鄭樊 徐剛 仇芳 鄭妃慶 鄭麗 謝昌平

摘要 紅皮深紅肉火龍果軟腐病主要發(fā)生在花瓣、鱗片和果實。采用組織分離法分離病原菌，通過瓊脂平板稀釋純化、致病性測定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法將病原鑒定為桃吉爾霉Gilbertella persicaria。生物學(xué)測定結(jié)果表明：該病原菌在15～37℃范圍內(nèi)均能生長，低于10℃不能生長，最適溫度32℃;最適pH 5.0～6.0;連續(xù)光照更有利于菌絲生長。

關(guān)鍵詞 紅皮深紅肉火龍果; 軟腐病; 病原鑒定; 桃吉爾霉; 生物學(xué)特性

中圖分類號： S 436.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018347

火龍果Hylocereus spp.又名紅龍果、情人果和仙蜜果等，因外表肉質(zhì)鱗片似龍鱗而得名，原產(chǎn)于墨西哥南部及中美洲諸國的太平洋沿岸地區(qū)，現(xiàn)在我國海南、福建、廣東、廣西、貴州和云南等?。ㄗ灾螀^(qū)）均有種植。大部分火龍果屬于仙人掌科，量天尺屬Hylocereus （Berger） Britton et Rose，其他則屬于蛇鞭柱屬Selenicereus Britton et Rose[1]?；瘕埞饕腥N商業(yè)種類：紅皮白肉火龍果Hylocereus undatus、紅皮紅肉火龍果H.polyrhizus和紅皮深紅肉火龍果H.costaricensis[2]。火龍果集水果、蔬菜、花卉于一體，營養(yǎng)豐富，深受消費者青睞，具有廣闊的發(fā)展前景。

目前，國內(nèi)外記載的火龍果病害有由Enterobacter cloacae[3]、Fusarium oxysporum和F.dimerum[4]、Erwinia sp.[5]引起的軟腐病，由F.oxysporum[5]引起的枯萎病，由Paenibacillus polymyxa[6]、Bipolaris cactivora[7]、F.semitectum、F.oxysporum和F.moniliforme[8]引起的莖腐病，Rhizopus stolonifer[9]引起的根霉病，由Botryodiplodia theobromae[8]引起的焦腐病，由Bipolaris cactivora、Scytalidium dimidiatum[8]、Fusarium spp.[10]、Gilbertella persicaria[1112]和F.dimerum[13]引起的果腐病，由Neoscytalidium dimidiatum[1415]引起的潰瘍病或褐斑病，由Colletotrichum gloeosporioides、C. truncatum[16] 和C.capsici[8]引起的炭疽病，Bipolaris cactivora[17]引起的黑斑病，由Phoma sp.、Diplodia sp.、Ascochyta sp.[18]引起的莖枯病，Cactus virus X[19]引起的病毒病，由Septogloeum sp.[20] 引起的莖斑病以及由Scytalidium dimidiatum[21]、Bipolaris cactivora[22]、F.lateritium、Aspergillus niger和A.flavus[23]引起的腐爛病等。

2016年，筆者在海南省昌江縣的火龍果種植基地發(fā)現(xiàn)一種危害紅皮深紅肉火龍果花瓣、鱗片和果實的軟腐病，發(fā)病部位初期產(chǎn)生水漬狀的病斑，病部覆蓋一層灰白色的霉層，嚴重時病斑擴大至全部花瓣、鱗片和果實，造成病部呈軟腐狀，嚴重影響其產(chǎn)量，而且在果實貯藏過程中該病引起成熟果實的大量腐爛變質(zhì)。本研究通過對紅皮深紅肉火龍果軟腐病的病原菌進行分離培養(yǎng)、純化、致病性測定、病原鑒定和生物學(xué)特性的研究，旨在弄清病原分類地位，掌握該病發(fā)病規(guī)律，從而為該病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

感病的紅皮深紅肉火龍果于2017年4月采自海南省昌江縣某火龍果種植基地。

1.2 癥狀描述

按常規(guī)方法對田間發(fā)病典型部位出現(xiàn)的癥狀進行描述，并拍攝病害的癥狀。

1.3 菌株的分離及純化

采用常規(guī)組織分離法[24]對病原菌進行分離，采用瓊脂平板稀釋純化法[25]進行純化，并將純化菌株轉(zhuǎn)入試管斜面于4℃保存。

1.4 致病性測定

將保存的菌株于PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2 d。采用刺傷接種法，在每個果實上刺傷4個點，在刺傷點上接種菌絲塊，以接種無菌PDA培養(yǎng)基為對照，試驗重復(fù)3次，用滅菌脫脂棉蘸取無菌水進行保濕，24 h后移去脫脂棉，在常溫25℃下，觀察發(fā)病情況。若接種果實發(fā)病則取發(fā)病部位再分離，完成柯赫氏法則驗證。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃全光照下培養(yǎng)2～3 d，觀察、記錄菌株的菌落形狀和顏色、病原菌孢子的形狀，測量孢子大小，并拍照。

1.5.2 病原菌DNA的提取及分子生物學(xué)鑒定

將供試病原菌接種于PDA上，25℃全光照下培養(yǎng)2～3 d，用無菌藥匙刮取菌絲體置于1.5 mL無菌離心管中，按照Fungal DNA Kit真菌基因組DNA快速抽提試劑盒（OMEGA BIO-TEK）說明，提取基因組DNA。PCR擴增試劑盒2×Es Taq Master Mix、擴增引物購自生工生物工程股份有限公司。

分別采用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）和LROR（5′-ACCCGCTGAACTTAA-GC-3′）/LR7（5′-TACTACCACCAAGATCT-3′）對序列進行擴增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：DNA模板 2 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol/L），2×Es Taq Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。ITS擴增程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃ 退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。LSU擴增程序為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán);最后72℃延伸7 min，4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測。PCR產(chǎn)物委托華大基因（深圳）股份有限公司純化和測序。測序結(jié)果在GenBank中進行BLAST，并下載相關(guān)序列，用MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 病原菌生物學(xué)特性

1.6.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響

將直徑為5.0 mm的菌餅接于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于15、20、25、28、30、32、35、37和40℃共9個不同溫度的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次。48 h后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6.2 pH對病原菌菌絲生長的影響

PDA培養(yǎng)基滅菌以后，無菌條件下用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH，將直徑為5.0 mm的菌餅分別置于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的PDA培養(yǎng)基平板上，于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次。48 h后用十字交叉法測量菌落直徑。

1.6.3 光照對病原菌菌絲生長的影響

將直徑為5.0 mm的菌餅接于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于連續(xù)光照、L∥D=12 h∥12 h、連續(xù)黑暗的32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理重復(fù)3次。48 h后用十字交叉法測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

病害主要危害花瓣、鱗片和果實。田間發(fā)病花瓣首先凋萎，初期產(chǎn)生水漬狀淡褐色病斑，病斑迅速擴展，造成整個花冠呈軟腐狀。病害繼續(xù)從花瓣擴展到鱗片，引起鱗片的軟腐，最終導(dǎo)致整個花冠和鱗片的軟腐（圖1a～b）。幼果發(fā)病引起果肉變?yōu)榘岛稚浉癄睿▓D1c）。果實成熟后病果上出現(xiàn)水漬狀病斑，病斑迅速擴大，1～2 d病斑擴大至全果實，果實呈軟腐狀。受危害的花瓣、鱗片和果實在后期均產(chǎn)生大量的白色至灰褐色霉層和黑褐色的球形孢子囊（圖1d～f）。病害多發(fā)生在開花期，發(fā)病率為15%。發(fā)病率與花剪除及時與否有關(guān)，花剪除及時，可降低發(fā)病率。貯藏期發(fā)病多是由采摘造成的機械損傷或潰瘍病造成的傷口侵染引起。

2.2 病原菌的致病性測定

對健康的紅皮深紅肉火龍果果實進行接種，以無菌的PDA為對照，5 d后針刺傷接種的果實全部發(fā)病，接種產(chǎn)生的癥狀與田間發(fā)病的癥狀相同（圖1g～h），而對照果實不發(fā)病（圖1i）。對發(fā)病組織進行再分離，可得到與原分離株相同的病原菌，符合柯赫氏法則，證明接種菌為火龍果軟腐病的致病菌。

2.3 病原菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)

在PDA上菌落圓形擴展，菌絲濃密（圖2a），氣生菌絲發(fā)達，無隔膜。孢囊梗暗褐色至淺褐色;多數(shù)直立，少數(shù)彎曲;1～2個分枝，多數(shù)為1個分枝。頂端產(chǎn)生1個孢子囊，球形，黑褐色，直徑90.00～133.81 μm， 平均110.57 μm。無假根和匍匐菌絲。囊軸球形，無色，直徑為47.30～73.04 μm， 平均65.12 μm（圖2b～d）。孢囊孢子淺褐色至褐色，短橢圓形或球形，球形孢囊孢子直徑6.38～10.03 μm， 平均8.21 μm，短橢圓形孢囊孢子大小為（6.01～11.25）μm×（5.28～9.42）μm， 平均8.61 μm×7.65 μm（圖2e）。根據(jù)病原菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征，初步鑒定為接合菌門、接合菌綱、毛霉目、吉爾霉屬、桃吉爾霉Gilbertella persicaria。

2.4 火龍果軟腐病病原系統(tǒng)發(fā)育分析

通過ITS和LSU 2對引物對菌株進行PCR擴增、測序，得到長度分別為611 bp和1 075 bp的序列（GenBank登錄號分別為：MH568797和MH578264）。將得到的序列在GenBank中進行比對，并對2個基因序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)MEGA 6.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的各個分支的支持強度通過1 000次重復(fù)的自展檢驗數(shù)值進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株HLGRF與Gilbertella persicaria聚為一個進化支（圖3），支持率為100%。依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將火龍果軟腐病病原菌鑒定為桃吉爾霉G.persicaria。

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

2.5.1 溫度對病原菌菌絲生長的影響

病原菌對溫度的適應(yīng)范圍很廣，在15～37℃范圍內(nèi)均能生長。在10～32℃范圍內(nèi)隨溫度的升高，菌落直徑隨之增大;在32～40℃范圍內(nèi)，菌絲生長隨溫度升高呈下降趨勢;菌絲生長的最適溫度為32℃，2 d后菌落直徑達79.0 mm，極顯著高于其他溫度下的菌落直徑。溫度低于10℃或高于40℃，菌絲不能生長（圖4）。

2.5.2 pH對病原菌菌絲生長的影響

病原菌菌絲在pH 3.0～11.0均能生長。在pH為3.0～5.0時，菌絲生長速率逐漸增快，在pH 5.0～6.0時，菌絲邊緣齊整，氣生菌絲發(fā)達，菌落大小差異不顯著，pH為5.0時菌落最大，直徑為67.8 mm最適pH為5.0。在pH為5.0～11.0范圍內(nèi)，隨著pH升高，菌絲生長速率逐漸下降（圖5）。

2.5.3 光照對病原菌菌絲生長的影響

病原菌在不同光照條件下均可生長，在不同條件下，菌落直徑存在顯著差異，在連續(xù)光照條件下菌落擴展最快，直徑為79.5 mm，其次是光暗交替條件，連續(xù)光照條件最有利于菌絲生長（圖6）。

3 結(jié)論與討論

通過病害田間癥狀觀察、致病性測定、病原菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，將引起海南紅皮深紅肉火龍果軟腐病病原確定為桃吉爾霉G.persicaria?；瘕埞母癄€病害大部分由鐮孢屬引起[26]，對桃吉爾霉引起的腐爛病害報道較少，有云南郭力維等[11]報道的火龍果果腐病，廣西林珊宇等[27]報道的火龍果軟腐病，而目前海南對桃吉爾霉屬引起的軟腐病并未見報道。該病菌在國外報道還可侵染海南蒲桃[28]、桃[29]、茄子[30]、番木瓜[31]和番茄[32]等，甚至可侵染蝦[33]。

本研究由桃吉爾霉引起的紅皮深紅肉火龍果軟腐病與已經(jīng)報道的匍枝根霉Rhizopus stolonifer引起的軟腐病[34]在癥狀上難以區(qū)別，但是病原菌形態(tài)明顯不同于匍枝根霉，匍枝根霉能產(chǎn)生假根和匍匐菌絲，孢囊梗不分枝和不彎曲，而桃吉爾霉不能產(chǎn)生假根和匍匐菌絲，孢囊梗多數(shù)1～2個分枝，個別孢囊梗頂端彎曲。

本文較為系統(tǒng)地研究了溫度、pH和光照對病原菌生長的影響，結(jié)果表明，該病原菌最適生長溫度為32℃，而據(jù)郭力維等[11]報道，該菌的最適溫度為30℃，本研究材料來自田間發(fā)病果實，郭力維等的材料來自市場上的火龍果，并且郭力維等沒有設(shè)置32℃的溫度;連續(xù)光照更有利于菌絲生長;最適pH為5.0～6.0。桃吉爾霉為一種弱寄生菌，病原菌只能通過傷口侵入，因此，在采收、貯運過程中應(yīng)減少機械損傷;根據(jù)生物學(xué)特性，該菌在10℃下不生長，貯存溫度應(yīng)低于10℃。同時，該病原菌常在土壤中有機質(zhì)或果園周圍腐敗植物病殘體上或火龍果腐敗的花瓣上存活，因此，該病害的防治措施主要是搞好田間衛(wèi)生工作，及時清理植物病殘體，同時，在火龍果開花后3～4 d應(yīng)及時剪除腐敗的花瓣，以減少病原菌的侵染來源。本研究明確了桃吉爾霉菌絲生長最適條件，為掌握病害發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而防治紅皮深紅肉火龍果軟腐病奠定了基礎(chǔ)。

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