彭建紅 李耀發(fā) 高占林 黨志紅 安靜杰 潘文亮

摘要 為了明確新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜和棉蚜拒食作用的差異，通過銣標記法、蜜露法以及兩種蚜蟲體內(nèi)總糖、總脂含量的測定研究了新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜和棉蚜取食的影響。結(jié)果表明，銣標記法和蜜露法測定的新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜的拒食率均在80%以上，而對棉蚜的拒食率均在25%以下。蚜蟲體內(nèi)總糖總脂含量測定結(jié)果表明，新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量處理后麥長管蚜體內(nèi)總糖、總脂含量均顯著低于對照，而棉蚜體內(nèi)總糖、總脂含量與對照均無顯著差異。三種方法測定結(jié)果一致表明新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜具有很強的拒食作用，而對棉蚜沒有明顯的拒食作用。

關(guān)鍵詞 麥長管蚜; 棉蚜; 新煙堿類殺蟲劑; 拒食作用

中圖分類號： S 482.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018348

亞致死劑量殺蟲劑可以對昆蟲的一些行為產(chǎn)生影響，如對昆蟲產(chǎn)生拒食、忌避、引誘等作用[1]。新煙堿類殺蟲劑是近年來不斷發(fā)展的一類可以有效防治刺吸式口器害蟲的新穎殺蟲劑，具有觸殺、內(nèi)吸、胃毒、拒食等多種作用方式[2]，在作物體內(nèi)低含量的情況下仍能保護作物免受害蟲為害，表現(xiàn)為拒食作用。國內(nèi)外在新煙堿類殺蟲劑的拒食作用方面已有一定的研究[35]。范文超等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，小麥經(jīng)吡蟲啉拌種后，在小麥孕穗期及灌漿期僅能檢測到微量的吡蟲啉，但其對麥蚜仍表現(xiàn)出較高的拒食作用。Devine等[7]研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉低劑量可對桃蚜和煙蚜的取食行為產(chǎn)生明顯的影響，表現(xiàn)出強烈的拒食作用。

已有研究表明吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑拌種防治小麥蚜蟲具有優(yōu)異的防治效果和超長的持效期，在整個小麥生長期無需再進行麥蚜防治[811]。但是，與小麥拌種相比，該類藥劑棉花拌種后對棉蚜田間持效期僅可維持40 d左右，只能保證棉花苗期不需藥劑防治[1214]。

本研究采用銣（Rb）標記法、蜜露法以及蚜蟲體內(nèi)總糖、 總脂含量測定等方法研究新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜和棉蚜取食行為的影響，以明確新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對兩種蚜蟲拒食作用差異的原因，本研究對新煙堿類殺蟲劑的合理使用具有重要的理論和指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥劑：98.5%吡蟲啉原藥，拜耳作物科學(xué)公司;97.1%啶蟲脒原藥，河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司;96.0%烯啶蟲胺原藥，河北德美化工有限責(zé)任公司;98.3%噻蟲啉原藥，拜耳作物科學(xué)公司;99.1%噻蟲嗪原藥，先正達南通作物保護有限公司;98.0%噻蟲胺原藥，拜耳作物科學(xué)公司;95.0%呋蟲胺原藥，河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司;96.3%吡蚜酮原藥，河北嘉博農(nóng)業(yè)有限公司。

將供試7種新煙堿類殺蟲劑（吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻蟲胺、呋蟲胺）原藥分別以丙酮為溶劑溶解配制成一定濃度的母液。將吡蚜酮原藥首先用適量的N-N-二甲基甲酰胺及二甲基亞砜溶劑完全溶解，然后用丙酮溶劑定容，最終配制成10 mg/mL的備用母液。

供試蟲源：麥長管蚜Sitobion miscanthi （Takahashi）于2016年5月采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊試驗基地田間自然種群，棉蚜Aphis gossypii Glover于2015年8月采自河北省滄州市獻縣棉田，均飼養(yǎng)于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所養(yǎng)蟲室[簡稱養(yǎng)蟲室，下同。溫度（20±2）℃，相對濕度60%～70%，L∥D=16 h∥8 h ]，在不接觸任何藥劑的情況下室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代。選擇身體健壯、生理狀態(tài)一致的無翅成蚜供試。

供試作物：小麥品種為‘石新733原種，產(chǎn)自河北省農(nóng)林科學(xué)院小麥種植基地;棉花品種為‘魯研棉20號，山東棉花研究中心提供。供試作物的培養(yǎng)采用水培法[15]，小麥植株培養(yǎng)到兩葉一心期，棉花植株培養(yǎng)到兩真葉期備用。將各供試藥劑母液用含有0.1%吐溫80的營養(yǎng)液進行稀釋，按照各供試藥劑的LC25濃度配制含藥營養(yǎng)液（表1，LC25濃度由前期試驗測定所得），小麥植株水培24 h，棉花植株水培48 h備用。以含有0.1%吐溫80的營養(yǎng)液水培植株作空白對照，吡蚜酮為藥劑對照。

主要儀器與試劑：7700x電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技有限公司;VHX-1000超景深三維顯微鏡，日本KEYENCE公司;Synergy H1酶標儀，美國伯騰儀器有限公司;Rb2SO4，上海麥克林生化科技有限公司;溴甲酚綠指示劑，天津市光復(fù)精細化工研究所;蒽酮，上海源葉生物科技有限公司;香蘭素，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 銣標記法

參照宋國晶等[16]的測定方法并加以改進。將500 mg/L Rb2SO4溶液加入小麥（或棉花）植株的培養(yǎng)液中對植株進行標記。然后各接入40～50頭麥長管蚜（或棉蚜），置于光照養(yǎng)蟲室中，麥長管蚜處理24 h，棉蚜處理48 h后挑取生理狀態(tài)一致的無翅成蚜30頭于離心管中，液氮中速凍，置于-20℃冰箱中保存待測，每個處理重復(fù)4次。

Rb含量檢測方法：將全部樣品轉(zhuǎn)移至20 mL聚四氟乙烯坩堝中，加優(yōu)級純硝酸0.5～1 mL，優(yōu)級純高氯酸0.2 mL，旋緊聚四氟乙烯坩堝外塞，于控溫電熱板上150℃加熱2 h，自然冷卻，去離子水定容至20 mL，等離子質(zhì)譜儀檢測。

1.2.2 蜜露法

參照范文超等[17]的測定方法并加以改進。選取大小均一的小麥葉片和棉花葉片，葉子正面用雙面膠粘到培養(yǎng)皿的皿蓋上，每皿接入5頭試蟲（試驗前饑餓處理1 h），將皿蓋輕輕蓋在已經(jīng)放好指示試紙的皿底上，用封口膜封好縫隙，讓試蟲在小麥葉片和棉花葉片背面取食和生活，蚜蟲排泄的蜜露滴在濾紙上即變成孔雀藍色。每隔6 h更換1次濾紙，觀測24 h。根據(jù)濾紙上蜜露的分布面積計算排蜜量。試驗重復(fù)4次。

指示試紙的制備：稱取0.2 g溴甲酚綠指示劑，溶于100 mL 20%的乙醇中配成0.2%的溴甲酚綠溶液，將直徑為9 cm的定性濾紙浸入配好的溶液中，取出后自然晾干備用，標準的濾紙呈鮮橘黃色[17]。

1.2.3 蚜蟲體內(nèi)總糖總脂含量測定方法

1.2.3.1 試蟲的準備

在藥劑處理后的小麥和棉花植株上各接入40～50頭麥長管蚜（或棉蚜），置于養(yǎng)蟲室中，麥長管蚜處理24 h，棉蚜處理48 h后，挑取生理狀態(tài)一致的無翅成蚜40頭，置于干燥箱中于70℃下烘干至恒重，稱重，記錄每個處理試蟲干重。每個處理重復(fù)4次。

1.2.3.2 總糖總脂含量測定方法

總糖和總脂的分離提取參照王燕[18]、Zhou等[19]的方法。

總糖含量測定采用硫酸蒽酮法，取分離提取好的總糖溶液1 mL于試管中，加入4 mL蒽酮試劑充分混勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫，再將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到96孔的酶標板中，在620 nm處測定吸光值。以葡萄糖建立標準曲線。

總脂含量測定采用香蘭素硫酸顯色法，取分離提取好的總脂溶液30 μL于試管中，90～100℃水浴蒸干，加入100 μL濃硫酸沸水浴10 min，在冰上冷卻到室溫后加入香蘭素試劑2.4 mL混勻，在室溫下黑暗中反應(yīng)15 min，再將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到96孔的酶標板中，在525 nm處測定吸光值。以甘油三酯建立標準曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析方法

分別以新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量處理后蚜蟲體內(nèi)銣含量減退率和蜜露排泄量降低率代表藥劑對蚜蟲的拒食率，并將處理后試蟲體內(nèi)總糖、總脂含量與對照試蟲比較，綜合分析藥劑對兩種蚜蟲的拒食作用。各拒食率及蚜蟲體內(nèi)總糖、總脂含量變化計算公式如下：

蜜露排泄量降低率=對照蚜蟲蜜露排泄量-處理蚜蟲蜜露排泄量對照蚜蟲蜜露排泄量×100%;

拒食率=對照蚜蟲平均含銣量-處理蚜蟲平均含銣量對照蚜蟲平均含銣量×100%;

總糖含量（μg/mg）=標準曲線查得的含糖量（μg）×提取液體積（mL）×稀釋倍數(shù)n測定時取用的體積（mL）×樣品重量（g）×1 000;

總脂含量（μg/mg）=標準曲線查得的含脂量（μg）×提取液體積（mL）×稀釋倍數(shù)n測定時取用的體積（mL）×樣品重量（g）×1 000。

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銣標記法測定新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對兩種蚜蟲的拒食作用

新煙堿類殺蟲劑處理后的麥長管蚜體內(nèi)Rb含量顯著低于對照蚜蟲體內(nèi)Rb含量，拒食率在83.89%～97.41%，其中噻蟲啉處理的麥長管蚜的拒食率最高，為97.41%，烯啶蟲胺處理的拒食率略低，為83.89%;新煙堿類殺蟲劑處理后棉蚜體內(nèi)Rb含量與對照相比沒有顯著差異，拒食率均低于10%。說明新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜具有很強的拒食作用，對棉蚜的拒食作用不明顯，有些藥劑可能對棉蚜存在一定的誘食作用。對照藥劑吡蚜酮處理后的麥長管蚜體內(nèi)Rb含量亦顯著低于對照蚜蟲體內(nèi)Rb含量，拒食率為78.44%;吡蚜酮處理后的棉蚜體內(nèi)Rb含量與對照相比無差異，拒食率僅為0.38%（表2）。

2.2 蜜露法測定新煙堿類殺蟲劑對兩種蚜蟲的拒食作用

新煙堿類殺蟲劑處理后的麥長管蚜蜜露排泄量顯著低于對照蚜蟲蜜露排泄量，新煙堿類殺蟲劑蜜露排泄量降低率均在85%以上;新煙堿類殺蟲劑處理后的棉蚜蜜露排泄量與對照相比均沒有顯著性差異，蜜露排泄量降低率均在25%以下。說明新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量顯著減少了麥長管蚜的取食量，能夠明顯抑制麥長管蚜的取食行為，對麥長管蚜具有很強的拒食作用，對棉蚜的拒食作用不明顯，有些藥劑可能對棉蚜存在一定的誘食作用。對照藥劑吡蚜酮處理后的麥長管蚜蜜露排泄量顯著低于對照蚜蟲蜜露排泄量，蜜露排泄量降低率為77.61%;吡蚜酮處理后的棉蚜蜜露排泄量與對照相比亦無差異（表3）。

2.3 新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對兩種蚜蟲體內(nèi)總糖總脂含量的影響

通過對麥長管蚜和棉蚜體內(nèi)總糖、總脂含量的測定發(fā)現(xiàn)，新煙堿類殺蟲劑處理后麥長管蚜體內(nèi)總糖、總脂含量均顯著低于對照（表4），而新煙堿類殺蟲劑處理后棉蚜體內(nèi)總糖、總脂含量與對照均無顯著差異（表5）。因此可以說明麥長管蚜體內(nèi)總糖、總脂含量的降低可能是由于麥長管蚜取食量的減少造成的，又進一步說明了新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜具有明顯的拒食作用，而對棉蚜這種拒食作用不明顯。對照藥劑吡蚜酮對兩種蚜蟲體內(nèi)總糖、總脂含量的影響與供試藥劑一致。

3 討論

微量元素銣（Rb）標記技術(shù)是目前昆蟲生態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用最普遍的標記技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于如昆蟲的取食行為、遷移擴散、生境選擇和配偶競爭等昆蟲生態(tài)學(xué)研究[1620]。本研究中采用銣標記法對兩種蚜蟲的取食行為進行研究，可有效避免藥劑對試蟲的觸殺及熏蒸作用，并且微量元素對昆蟲的生長發(fā)育及取食不會產(chǎn)生任何影響，也不會因為蛻皮而使昆蟲失去標記。該方法沒有放射性，對試驗人員、試驗昆蟲及周圍環(huán)境安全，是一種較好的用于昆蟲取食行為研究的方法。

前人針對新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對試蟲拒食作用的研究，多采用葉面噴霧[21]、浸葉[22]、涂莖[23]及拌種[17]等方法處理，根據(jù)蚜蟲蜜露排泄量研究藥劑的拒食作用。或采用浸葉法、內(nèi)吸法處理植物葉片，根據(jù)試蟲棲息率分析藥劑對試蟲的拒食效果[24]。Nauen等[21]研究發(fā)現(xiàn)葉面噴施亞致死劑量的吡蟲啉后可顯著減少桃蚜的蜜露排泄量。范文超[17]對經(jīng)吡蟲啉拌種的小麥植株不同時期蚜蟲蜜露排泄量進行測定，發(fā)現(xiàn)不同時期蜜露排泄量顯著降低。Daniels等[23]研究發(fā)現(xiàn)用亞致死劑量噻蟲嗪涂莖法處理小麥植株后可顯著減少蚜蟲蜜露排泄量。本研究采用蜜露法測定新煙堿類殺蟲劑對兩種蚜蟲蜜露排泄量的影響，結(jié)果表明麥長管蚜蜜露排泄量與對照相比顯著降低，此結(jié)果與Nauen等[21]、范文超[17]、Daniels等[23]的研究結(jié)果基本一致。本研究中多種方法測定的新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜和棉蚜的拒食作用研究結(jié)果一致表明，新煙堿類殺蟲劑亞致死劑量對麥長管蚜具有很強的拒食作用，而對棉蚜拒食作用不明顯。分析原因可能由于與麥長管蚜相比棉蚜存在很強的抗藥性，雖然本研究中所用棉蚜試蟲在室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)多代，但棉蚜種群本身對環(huán)境的適應(yīng)能力很強，藥劑亞致死劑量不足以對棉蚜的正常生長及取食產(chǎn)生不良影響。此結(jié)果也在某種程度上解釋了新煙堿類殺蟲劑拌種小麥能夠在中后期植株體內(nèi)藥劑殘留極微的情況下具有全生育期控制麥蚜的超長持效作用，而拌種棉花對棉蚜控制作用只有40 d左右的原因。

[20]宋國晶，封洪強，李國平，等.銣對兩種盲蝽及其寄主植物的標記與影響[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報，2012，49（3）：614619.

[21]NAUEN R，HUNGENBERG H，TOLLO B，et al. Antifeedant effect，biological efficacy and high affinity binding of imidacloprid to acetylcholine receptors in Myzus persicae and Myzus nicotianae [J]. Pesticide Science， 1998，53（2）：133140.

[22]吳咚咚. 吡蟲啉對煙粉虱實驗種群的亞致死影響[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

[23]DANIELS M，BALE J S，NEWBURY H J，et al. A sublethal dose of thiamethoxam causes a reduction in xylem feeding by the bird cherry-oat aphid （Rhopalosiphum padi），which is associated with dehydration and reduced performance [J]. Journal of Insect Physiology，2009，55（8）：758765.

[24]NAUEN R，BIRGIT K，ALFRED E. Antifeedant effects of sublethal dosages of imidacloprid on Bemisia tabaci [J].Entomologia Experimentalis et Applicata. 1998，88（3）：287293.

[25]高志山，張學(xué)峰，劉海濤，等.新煙堿類殺蟲劑種子包衣防治麥蚜的可行性評價[J].植物保護學(xué)報，2016，43（5）：864872.

[26]韓招久，肖旭，姜志寬，等.植物源昆蟲拒食劑研究進展[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2014，20（6）：511515.

[27]張慶臣，薛明，王鉦，等.新煙堿類等殺蟲劑對蔥蠅的毒力及其對生長發(fā)育和繁殖的影響[J].植物保護學(xué)報，2011，38（2）：159165.

（責(zé)任編輯：田 喆）