先天性心臟缺損(CHD)是人類最多見的出生畸形，在新生兒中的發(fā)病率為1%左右，約占全部出生畸形的1/3[1]。嚴(yán)重CHD 可導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育障礙或腦損傷、血栓栓塞、肺動脈高壓、細(xì)菌性肺炎或心內(nèi)膜炎、心功能不良或心力衰竭、房性或室性心律失常和心源性猝死等[1-3]。流行病學(xué)及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CHD主要與遺傳缺陷有關(guān)，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的60多個CHD致病基因中，大部分基因編碼心臟轉(zhuǎn)錄因子[4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，心臟轉(zhuǎn)錄因子基因NR2F2突變可導(dǎo)致單純型及綜合征型CHD[5-8]。由于CHD具有顯著的臨床及遺傳異質(zhì)性[4]，有必要在不同CHD人群中研究NR2F2基因與CHD的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

自2015年4月至2017年12月入選了104例CHD患者和208名匹配的非CHD對照者，均來自中國上海地區(qū)漢族人群，均經(jīng)詢問病史及家族史、體格檢查、常規(guī)化驗檢查和心臟彩色多普勒超聲檢查。在104例CHD患者中，男性61例，女性43例，年齡為1～12歲，平均年齡4歲，有陽性家族史者12例；在208名非CHD對照者中，男性122例，女性86例，年齡為1～11歲，平均年齡4歲，均無CHD患者家族史。經(jīng)患者監(jiān)護(hù)人知情同意后，收集患者外周靜脈血約1 mL，使用血液DNA分離試劑盒(中國Sangon公司)提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 NR2F2基因擴(kuò)增 擴(kuò)增NR2F2基因編碼區(qū)、剪接點及部分5′和3′端非翻譯區(qū)所用的特異性引物序列見參考文獻(xiàn)[6]。以基因組DNA為模板，使用熱啟動Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)和NR2F2基因擴(kuò)增引物等試劑在PTC-220型PCR儀(美國MJ Research公司)上通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增NR2F2基因片段。每一PCR反應(yīng)物的總體積是50 μL，包括dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL、10×PCR緩沖液5 μL、基因組DNA(100 ng/μL)2μL、上游引物(20 μmol/L)1 μL 、下游引物(20 μmol/L)1 μL、熱啟動 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL和雙蒸水36.5 μL。PCR條件參考試劑說明書設(shè)定如下：共35個循環(huán)，每一循環(huán)包括98 ℃ 變性10 s、62 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增的目的基因片段經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收后用凝膠純化試劑盒(中國Sangon公司)純化。

1.2.2 NR2F2基因測序分析 以上述純化的目的基因片段為模板，使用正向或反向NR2F2基因特異性擴(kuò)增引物和DNA循環(huán)測序試劑盒(美國Thermo Fisher公司)在ProFlex型PCR儀(美國Thermo Fisher公司)上進(jìn)行測序反應(yīng)。測序PCR混合物的總體積為20 μL，其中純化的DNA片段(20 ng/μL)4 μL、預(yù)混合液8 μL、上游或下游引物(2 μmol/L) 1 μL、雙蒸水7 μL。測序PCR的條件設(shè)置依據(jù)試劑說明書：共30個循環(huán)，每一循環(huán)包括95 ℃ 變性20 s、50 ℃退火15 s和60 ℃延伸1 min。測序PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后在3730 XL型DNA測序儀(美國Thermo Fisher公司)上進(jìn)行測序。將所測出的NR2F2序列與Nucleotide數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)中的NR2F2序列(登陸號：NM_021005.3)進(jìn)行對比分析以發(fā)現(xiàn)NR2F2基因變異。一旦發(fā)現(xiàn)NR2F2基因變異，就檢索中外各數(shù)據(jù)庫 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php、http://gnomad.broadinstitute.org、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed、http://librarian.wanfangdata.com.cn)以確定所發(fā)現(xiàn)的基因變異是否有過報道。

1.2.3 突變位點氨基酸的保守性分析 通過Nucleotide數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)下載所有可獲得物種的NR2F2蛋白之氨基酸序列，借助在線軟件ClustalW2(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)評估突變氨基酸在物種進(jìn)化上是否保守。

1.2.4 NR2F2基因變異的致病性分析 使用在線軟件MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)、PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和PROVEAN(http://provean.jcvi.org)分析所檢測出的NR2F2基因變異是否具有致病性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分類變量以個數(shù)或百分比表示。病例組與對照組間連續(xù)變量的比較使用Student′st檢驗；分類變量的比較使用Pearson′sχ2檢驗或Fisher′s精確概率檢驗。雙側(cè)檢驗值P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)現(xiàn)NR2F2基因新突變

通過PCR-測序分析104例CHD患者的NR2F2基因，在其中1例家族史陰性的動脈導(dǎo)管未閉合并室間隔缺損患者發(fā)現(xiàn)了1個NR2F2基因雜合突變，其NR2F2基因編碼核苷酸序列第1189位的胞嘧啶(C) 變?yōu)樾叵汆奏?T)，即c.1189C>T突變，這導(dǎo)致NR2F2蛋白之氨基酸序列第397位的精氨酸(Arg)變?yōu)樯彼?Trp)，即p.Arg397Trpr突變。該錯義突變不存在于208名非CHD對照者。經(jīng)過查詢HGMD、genomAD、SNP、PubMed和萬方數(shù)據(jù)庫，均無NR2F2基因c.1189C>T變異報道，表明該NR2F2基因c.1189C>T突變是1個新突變。NR2F2基因c.1189C>T雜合突變及其純合野生型堿基序列見圖1。

注：箭頭所指分別為NR2F2基因c.1189C>T雜合突變型T/C和純合野生型C/C序列

2.2 突變位點氨基酸在多物種進(jìn)化上保守

NR2F2蛋白序列與已知物種包括人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑馬魚、果蠅、蚊蟲和蟾蜍等的NR2F2蛋白序列比對分析表明，第397位的精氨酸在多物種進(jìn)化上完全保守。多物種NR2F2蛋白之氨基酸序列比對分析結(jié)果見圖2。

注：箭頭所指為NR2F2蛋白之氨基酸序列第397位的精氨酸

2.3 NR2F2基因

c.1189C>T突變有致病性，該NR2F2基因c.1189C>T突變被MutationTaster軟件預(yù)測為致病性突變，預(yù)測結(jié)果正確的概率值約為1.00；被PolyPhen-2預(yù)測為致病性突變，預(yù)測值為1.00(敏感性為0，特異性為1.00)；被PROVEAN預(yù)測為致病性突變，預(yù)測值為-5.68。

3 討論

本研究在1例散發(fā)性動脈導(dǎo)管未閉合并室間隔缺損患者中識別出了1個新的NR2F2基因雜合錯義突變c.1189C>T(p.Arg397Trp)，但該雜合錯義突變不存在于208名非CHD對照者。該突變位點上的精氨酸在人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑馬魚、果蠅、蚊蟲和蟾蜍等物種進(jìn)化上完全保守，而且在線計算機(jī)功能預(yù)測分析軟件MutationTaster、PolyPhen-2和PROVEAN均預(yù)測該突變是致病性突變。因此，NR2F2基因c.1189C>T(p.Arg397Trp)突變極有可能是該CHD患者的分子病因，但該基因突變的致CHD機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

NR2F2基因定位于人15號染色體15q26.2，編碼一種由414個氨基酸殘基所組成的轉(zhuǎn)錄因子蛋白，即核受體2亞族F組2號成員(NR2F2)，也被稱作雞卵上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子2(COUP-TFII)[6]。NR2F2對胚胎期心血管的正常發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，主要是在胎兒心臟通過與其轉(zhuǎn)錄合作伙伴如GATA4調(diào)節(jié)多個關(guān)鍵基因如ANF的表達(dá)而實現(xiàn)的[6]，而GATA4是重要的CHD致病基因，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)越來越多的GATA4突變可導(dǎo)致CHD[4]。因此，NR2F2基因突變可能通過影響NR2F2并與GATA4一起協(xié)同調(diào)節(jié)心臟發(fā)育關(guān)鍵靶基因的表達(dá)而導(dǎo)致CHD。

NR2F2大量表達(dá)于小鼠胚胎心臟，NR2F2基因敲除可因心血管發(fā)育異常導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡，主要表現(xiàn)有嚴(yán)重出血以及心房和靜脈竇不能發(fā)育到原始心管階段[9]。另外，內(nèi)皮特異性敲除NR2F2可因可導(dǎo)致多種心血管發(fā)育畸形，包括左房發(fā)育不良、心室發(fā)育不良、心內(nèi)膜發(fā)育不良、房室間隔缺損和冠狀動脈畸形[10]。這些動物實驗結(jié)果表明NR2F2在心血管正常發(fā)育方面有重要作用。

NR2F2大量表達(dá)于人類胚胎心臟的心房、主動脈和冠狀動脈，NR2F2基因突變可導(dǎo)致室間隔缺損、房室間隔缺損、主動脈縮窄、法洛四聯(lián)征、主動脈狹窄和左室發(fā)育不良綜合征[5]。Qiao等[6]等報道NR2F2基因突變導(dǎo)致右心室雙流出道合并室間隔缺損。Bashamboo等[7]等報道NR2F2基因突變可導(dǎo)致睪丸和心臟發(fā)育畸形，而Upadia等[8]報道NR2F2基因突變可導(dǎo)致心臟和面部發(fā)育畸形。本研究發(fā)現(xiàn)，NR2F2基因突變導(dǎo)致動脈導(dǎo)管未閉合并室間隔缺損，擴(kuò)大了NR2F2基因相關(guān)的表型譜，進(jìn)一步顯示NR2F2缺陷的致CHD作用。