李惠敏， 李璐璐， 陳玉梅， 李佳慧

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)屬葫蘆科藤本落葉植物，具有一年種多年生的塊根狀宿根性，其藥食兩用的果實(shí)被譽(yù)為“東方神果”，全球90%以上的羅漢果產(chǎn)于廣西桂林地區(qū)[1-2]。根結(jié)線蟲病是一類危害大、分布廣、防治難的植物病蟲害，也是羅漢果生產(chǎn)中的主要病害之一。根結(jié)線蟲不僅危害羅漢果植株根部，破壞根組織的分化和生理活動(dòng)，導(dǎo)致地上部分生長發(fā)育遲緩、推遲開花結(jié)果或不開花結(jié)果，同時(shí)還會加重枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細(xì)菌病害的發(fā)生，有的果園未到結(jié)果盛期就因嚴(yán)重感染根結(jié)線蟲病而被迫淘汰，損失極為嚴(yán)重[3-4]。因此，如何防治根結(jié)線蟲病是目前羅漢果種植中迫于要解決的主要問題之一，而利用生物技術(shù)進(jìn)行抗性育種被認(rèn)為是在植物生物防治中最有前景的策略[5]。

幾丁質(zhì)酶( EC 3. 2. 1. 14)是一種能夠?qū)锥≠|(zhì)水解成N-乙酰葡萄糖胺的糖苷酶[6]。因真菌細(xì)胞壁均含有幾丁質(zhì)，線蟲的卵殼和表皮中也含有幾丁質(zhì)物質(zhì)，幾丁質(zhì)酶作為病原物和寄主植物相互作用中的一種重要蛋白質(zhì)，已成為在植物抗病蟲害研究中的熱點(diǎn)[7]。植物雖然不含幾丁質(zhì)，但也存在著幾丁質(zhì)酶基因，植物幾丁質(zhì)酶可分布于植物的莖、葉、種子及愈傷組織中，分子量為25～55 kDa，多為單體，呈酸性或堿性，主要是內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，它隨機(jī)水解幾丁質(zhì)內(nèi)部β-1， 4- 糖苷鍵，釋放出寡糖[8-12]，植物幾丁質(zhì)酶部分家族成員還具有溶菌酶同源性[13-14]，相關(guān)研究也表明植物幾丁質(zhì)酶的高水平表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對害蟲、病原菌和環(huán)境脅迫的抵抗能力[10-12，15-16]。

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-Seq) 目前被廣泛應(yīng)用于植物抗病性等相關(guān)基因的鑒定與分析[16-20]，本研究基于RNA-Seq技術(shù)獲得羅漢果根系轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對其中的幾丁質(zhì)酶基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，期望為今后研究幾丁質(zhì)酶對羅漢果植株根結(jié)線蟲病抗性分子機(jī)理提供參考，為羅漢果抗性育種提供基因來源。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果為當(dāng)?shù)卦耘嗥贩N青皮果，屬于南方根結(jié)線蟲易感品種，以羅漢果幼苗根系為植物材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，委托上海派森諾生物科技有限公司Illumina HiSeq 2500 平臺進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果幾丁質(zhì)酶基因鑒定及理化特性分析

基于羅漢果幼苗根系的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及其注釋結(jié)果，將搜索到的注釋為幾丁質(zhì)酶的Unigene通過開放閱讀框ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)和預(yù)測保守域CD Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線軟件檢測確認(rèn)，篩選出含GH18或GH19基因家族成員結(jié)構(gòu)域特征且具有完整ORF的Unigene序列。將鑒定到的羅漢果幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列使用ExPAsy (http//www.expasy.org/)進(jìn)行在線預(yù)測其理化特性和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

1.2.2 信號肽預(yù)測及亞細(xì)胞定位

利用TargetP[21](http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和在線軟件CELLO v2.5[22]對15條羅漢果幾丁質(zhì)酶序列進(jìn)行信號肽預(yù)測和亞細(xì)胞定位。

1.2.3 羅漢果幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析

基于幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列，采用MEGA6.0鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)缺失序列刪除的方式，構(gòu)建羅漢果幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap=1 000)。并以NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載的19條擬南芥幾丁質(zhì)酶序列(本研究中將其編號AtCht1到AtCht19，序列相關(guān)信息見表1)為參考，對羅漢果幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分組。利用 DNAMAN軟件、MEME和Phyre2[23]在線工具對羅漢果幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

表1擬南芥幾丁質(zhì)酶序列信息Table 1 Chitinases in Arabidopsis thaliana downloaded from NCBI

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果幾丁質(zhì)酶基因家族成員的鑒定與理化性質(zhì)分析

基于南方根結(jié)線蟲侵染早期羅漢果根系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，搜索到注釋為幾丁質(zhì)酶基因的Unigene共有28條，然后分別經(jīng)ORF finder和CD-Search確認(rèn)具有完整開放閱讀框ORF和GH18或GH19基因家族成員結(jié)構(gòu)域特征的Unigene，最后共鑒定到15條羅漢果幾丁質(zhì)酶Unigene，命名為SgCht1到SgCht15(見表2)，ORF finder在線預(yù)測其編碼的幾丁質(zhì)酶前體氨基酸數(shù)目最少的為SgCht6 (260個(gè))，最大的為SgCht12和SgCht15(均是343個(gè))。利用 ExPASy在線軟件對羅漢果幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果見表2，羅漢果幾丁質(zhì)酶的分子量在27 kDa到37 kDa之間，多數(shù)為酸性蛋白質(zhì)，只有SgCht1、SgCht4和SgCht9的理論等電點(diǎn)大于8.0；不穩(wěn)定系數(shù)顯示SgCht1、2、4、6、7、10、11和14為穩(wěn)定蛋白，其余為不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性顯示SgCht1、2、9、12、13為疏水性蛋白，其余均屬于親水性蛋白。

表2 羅漢果幾丁質(zhì)酶特征Table 2 Characteristics of chitinases in Siraitia grosvenorii

2.2 信號肽預(yù)測及亞細(xì)胞定位結(jié)果

信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，本研究鑒定到的15個(gè)羅漢果幾丁質(zhì)酶前體其N端均有一段長度范圍為19-30個(gè)氨基酸殘基的信號肽(見表2)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示這些幾丁質(zhì)酶均定位在胞外。

2.3 羅漢果幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)發(fā)育分析及分類

植物中的幾丁質(zhì)酶主要為糖苷水解酶18家族和19家族成員(GH18和GH19)，根據(jù)氨基酸序列特征，植物的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶分為5 類，GH18包含III類和V類植物幾丁質(zhì)酶， GH19包含Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅳ類[13-14]。本研究以擬南芥幾丁質(zhì)酶的分類為參考，基于幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖1所示，15條羅漢果幾丁質(zhì)酶序列(圖中星號所示)歸為3類即SgCht11屬于I類；SgCht6、SgCht7和SgCht10屬于IV類，其余為III類。

DNAMAN9多序列比對結(jié)果顯示，Ⅰ類和IV類具有兩個(gè)高度保守區(qū)，這兩個(gè)保守區(qū)由一段富含脯氨酸、甘氨酸和精氨酸的可變交聯(lián)區(qū)(見圖2 ，虛線下劃線所示)相隔開，N端高度保守區(qū)富含半胱氨酸(見圖2，虛線框所示)，其作用是與幾丁質(zhì)結(jié)合，簡稱CBD(Chitin-binding domain)；C端是高度保守的催化區(qū)，有三個(gè)活性位點(diǎn)(見圖2 實(shí)線方框所示)。IV類幾丁質(zhì)酶(SgCht6、SgCht7和SgCht10)與I類(SgCht11)相比有4 處缺失(見圖2)，氨基酸數(shù)目(見表1)明顯比Ⅰ類少。

羅漢果GH18家族成員全部是III類幾丁質(zhì)酶，它們不含與幾丁質(zhì)結(jié)合的富半胱氨酸功能域， 而且僅有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，根據(jù)活性中心是否是谷氨酸殘基分為幾丁質(zhì)酶和類幾丁質(zhì)酶(見圖3，虛線框所示)，SgCht1、2、4、8、9、12和SgCht15均有一個(gè)谷氨酸活性中心，SgCht5、SgCht13缺失了谷氨酸活性中心，而SgCht3和SgCht14的活性中性則分別是天冬氨酸和丙氨酸殘基。

圖1 羅漢果與擬南芥幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of chitinases from Siraitia grosvenorii and Arabidopsis thaliana

圖2 GH19基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of conserved regions of GH19 amino acid sequences

圖3 GH18 基因家族成員保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of conserved regions of GH18 amino acid sequences

2.4 羅漢果幾丁質(zhì)酶序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

利用 MEME 5.0.4軟件對15個(gè)羅漢果幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列進(jìn)行motif查找，設(shè)置查找motif數(shù)目為6個(gè)，其余參數(shù)為默認(rèn)值，結(jié)果如圖4所示，GH18家族成員均具有motif1、motif2和motif4；而GH19家族成員僅有motif6。

圖4 羅漢果幾丁質(zhì)酶蛋白基序Fig.4 Motifs of chitinase in Siraitia grosvenorii

GH18基因家族成員編碼的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)具有典型的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)，即外部為 8 個(gè)α螺旋域，內(nèi)部為 8 個(gè)平行的β折疊域[24]，而GH19家族成員僅有α螺旋結(jié)構(gòu)域。圖5顯示了羅漢果幾丁質(zhì)酶GH18基因家族成員SgCht12(見圖5a)和GH19家族成員SgCht6(見圖5b)由Phyer2軟件預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)模型。其中，SgCht12 以c6idnA結(jié)構(gòu)為模板，有 268個(gè)氨基酸殘基與模板達(dá)到 100 %的可信度；SgCht6以c4mckA結(jié)構(gòu)為模板，有199個(gè)氨基酸殘基與模板達(dá)到100%的可信度。

圖5 三級結(jié)構(gòu)模型
Fig.5 Tertiary structure of SgCht12(a)and SgCht6(b)

3 結(jié)論與討論

羅漢果為廣西特有經(jīng)濟(jì)植物，但羅漢果植株易感根結(jié)線蟲病[3-4]，被根結(jié)線蟲感染后的羅漢果植株更容易被其他病菌的侵害，其中原因未見報(bào)道。幾丁質(zhì)是N-乙酰葡聚胺以β-1， 4-糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量僅次于纖維素的一大類可再生聚合物，廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲、真菌等生物[25-26]。線蟲卵殼及表皮的主要組成成分是幾丁質(zhì)，與真菌病原物一樣，植物被線蟲侵染時(shí)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶[7]。幾丁質(zhì)酶作為病原物和寄主植物相互作用中的一種重要蛋白質(zhì)，已成為在植物抗病蟲害研究中的熱點(diǎn)[5-7]。在植物抗病基因工程中，通過過量表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因來提高植物抗病性相關(guān)研究已有報(bào)道[12，15，27-28]。郭悅等[12]將克隆到的花生幾丁質(zhì)酶基因AhChi進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)功能，結(jié)果表明轉(zhuǎn)植株在黑斑病菌接種7d時(shí)其葉片褐化及壞死程度明顯較非轉(zhuǎn)基因植株要輕。谷天燕等[15]通過兩端融合表達(dá)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法不但提高了幾丁質(zhì)酶對ɑ-幾丁質(zhì)和黑曲霉幾丁質(zhì)的結(jié)合能力和活性，同時(shí)也增強(qiáng)了其對病原真菌長枝木霉的抑制作用；南相日[27]的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)菜豆幾丁質(zhì)酶基因的馬鈴薯抗病性比對照提高了30%；王果萍等[28]也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶對鐮刀菌引起的西瓜枯萎病有一定的抑制作用。隨著對幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理研究的深入[29-31]，通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段提高植物對真菌、昆蟲、線蟲等病害抗性將為有效生物防治提供新途徑。本研究采用生物信息學(xué)方法從羅漢果根系轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中鑒定到15個(gè)羅漢果幾丁質(zhì)酶基因，并對其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化特性預(yù)測及系統(tǒng)發(fā)育分析，可為羅漢果幾丁質(zhì)酶基因生物學(xué)功能的鑒定提供理論基礎(chǔ)，為羅漢果的抗病育種提供基因來源參考。本研究對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的羅漢果幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)進(jìn)行差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種根結(jié)線蟲7 d， SgCht12基因和SgCht14出現(xiàn)顯著性下調(diào)表達(dá)，分別是未接種根結(jié)線蟲的0.17倍和0.21倍，這是否意味著已經(jīng)被入侵的根結(jié)線蟲建立了取食位點(diǎn)的羅漢果植株，很有可能由于幾丁質(zhì)酶的表達(dá)受到了抑制而導(dǎo)致對其他病菌的侵染更為敏感？這有待今后對羅漢果幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)功能進(jìn)行更深入的研究來進(jìn)一步確定。