黃 勁， 王 潔， 高 霄， 雷依麗， 楊光紅, 馮永紅， 秦蓮花*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴陽 550025；3.同濟(jì)大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬上海市肺科醫(yī)院 上海市結(jié)核病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433；4. 貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院， 貴陽 550025)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的一種與機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答密切相關(guān)的慢性消耗性傳染病，宿主免疫細(xì)胞可通過其表面受體識別結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白中特殊的化學(xué)基團(tuán)，即表位 (Epitope) 而刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但其機(jī)制和宿主免疫保護(hù)機(jī)制仍不清楚[1]。因此，探索結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原表位的免疫學(xué)特性，對結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制的研究和表位疫苗的研發(fā)具有重要意義[2]。越來越多的研究顯示，結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)生長必需的基因及其產(chǎn)物可作為有效的藥物研發(fā)靶點(diǎn)和候選疫苗[3]。

核苷酸是結(jié)核分枝桿菌生長和分化的必需物質(zhì)，主要由從頭合成途徑產(chǎn)生[4]。其中，乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶(Orotidine 5’-monophosphate decarboxylase, OMPdecase; Rv1385)是嘧啶核苷酸從頭合成途徑最后一步反應(yīng)的酶，催化乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧生成尿嘧啶核苷酸[5]。尿嘧啶核苷酸是合成其他嘧啶核苷酸的前體，對促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的分化和增殖具有重要作用[6]。

Rv1385蛋白由結(jié)核分枝桿菌pyrF基因編碼，包含274個(gè)氨基酸殘基，富含丙氨酸、甘氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸，其相對分子質(zhì)量為27.4 KD。生物信息學(xué)分析顯示，Rv1385蛋白不含信號肽，亞細(xì)胞定位可能為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿[7]。迄今，對Rv1385的抗原性研究尚無報(bào)道，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對Rv1385的抗原性進(jìn)行預(yù)測分析，以期為后續(xù)深入研究結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制和新的藥物靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列

從NCBI數(shù)據(jù)庫檢索獲得結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)H37Rv及15株M.tuberculosis菌株的Rv1385蛋白氨基酸序列，序列號分別為：AJF02736、WP_031708180.1、WP_031734789.1、WP_017487696.1、WP_118962198.1、 WP_031658710.1、WP_016720430.1、WP_070892765.1、WP_055366474.1、 WP_052635252.1、WP_057361138.1、WP_055375288.1、WP_116258713.1、WP_057370066.1, WP_015631297.1 和WP_019283631.1。

1.2 Rv1385的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

應(yīng)用在線軟件PSIPRED Server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)。

1.3 Rv1385的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

應(yīng)用在線軟件BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/) 和ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)預(yù)測該蛋白的B細(xì)胞抗原表位。

1.4 Rv1385的CTL抗原表位預(yù)測

應(yīng)用BIMAS(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)及NetCTLpan 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLpan/)預(yù)測該蛋白的CTL表位。

1.5 Rv1385的Th抗原表位預(yù)測

應(yīng)用SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和NetMHCIIpan 3.2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/)預(yù)測該蛋白的Th細(xì)胞表位。

1.6 Rv1385氨基酸序列的同源性預(yù)測

應(yīng)用Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)對該蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rv1385的二級結(jié)構(gòu)

PSIPRED Server結(jié)果見圖1，其中α螺旋(H)、β折疊(E)、無規(guī)卷曲(C)分別占51.8%、41.6%和6.6%。

2.2 Rv1385的B細(xì)胞抗原表位

BepiPred 1.0 Server 預(yù)測結(jié)果顯示95～101、109～124、152～169、178～192、198～209、218～236, 249～260等氨基酸區(qū)段可能具有抗原表位；ABCpred預(yù)測具有抗原表位可能性最大的位點(diǎn)依次為109～124、94～109、120～135、189～204、195～210、147～162、65～80, 168～183位點(diǎn)。綜合兩種軟件預(yù)測結(jié)果的分值(≥0.65)，同時(shí)結(jié)合Rv1385蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果無規(guī)卷曲存在的區(qū)段進(jìn)行分析，推測B細(xì)胞抗原表位較有可能位于109～124、152～169、178～192, 198～209等氨基酸區(qū)段。

2.3 Rv1385的CTL表位

應(yīng)用3種生物信息學(xué)軟件預(yù)測，分值較高的CTL表位結(jié)果見表1，綜合分析，推測可能性較高的CTL表位存在于OMPdecase蛋白的下述氨基酸區(qū)段：263～271、87～95, 240～248。

圖1 Rv1385二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.1 Predicted secondary structure of Rv1385

表型分類BIMASSYFPEITHINetCTLpan起始位置氨基酸序列起始位置氨基酸序列起始位置氨基酸序列HLA-A2263RMRDAVAYL75263VLERTIAELRMRDAVAYL263RMRDAVAYLHLA-A3887VLVLADAKRRLAEAKARR5187AFADFAVVKDVLVLADAK//HLA-B712240KARRGPLCLLPAVAREVL200240APQAPDLSALPAVAREVL124240SPYLGFGSLLPAVAREVL

2.4 Rv1385的Th表位

SYFPEITHI 和NetCTLpan 3.2 Server在線軟件預(yù)測，分值較高的Th表位結(jié)果見表2，綜合2種軟件結(jié)果推測Th表位可能位于77～91、87～101、234～247、70～84, 46～60。

表2 Rv1385Th表位預(yù)測結(jié)果Table 2 Predicted Th epitopes of Rv1385

2.5 Rv1385的氨基酸序列同源性分析

運(yùn)用NCBI的Blast對M.tuberculosiscomplex數(shù)據(jù)庫的101株菌株的Rv1385進(jìn)行氨基酸序列比對，結(jié)果顯示一致性為81.32%～100%。然后從中選擇一致性較低的16株M.tuberculosis菌株進(jìn)行同源性分析，結(jié)果見圖2。

3 討 論

結(jié)核病仍然是全球性健康性疾病，據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織的結(jié)核病報(bào)告報(bào)道，目前全世界有近1/3人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年大約有180萬人死于結(jié)核病[8]。盡管自1990年以來，結(jié)核病的發(fā)病率和新增病例有所下降，但隨著多重耐藥和廣泛耐藥結(jié)核菌株的增多，以及結(jié)核和人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)共同感染患者的出現(xiàn)，給結(jié)核病的防治帶來巨大挑戰(zhàn)[9]。

圖2 不同菌株Rv1385氨基酸序列的同源性分析Fig. 2 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of Rv1385 from different strains

4 結(jié) 論

Rv1385含有潛在的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位，本文結(jié)果為結(jié)核特異診斷和多表位結(jié)核疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。