張宸，韓真

（陜西地建房地產(chǎn)開發(fā)集團有限責(zé)任公司，陜西西安 710075）

聚谷氨酸是由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體縮合而成的環(huán)境友好型高分子材料，具有良好的水溶性、生物降解性及生物兼容性，在食品、醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究前期從納豆中分離到一株高產(chǎn)γ-PGA的納豆芽孢桿菌HSF 1410，在發(fā)酵過程中添加 0.1‰（w/v）的 CaCl2能有效降低發(fā)酵液黏度，提高γ-PGA產(chǎn)量，且不會引起γ-PGA分子量變化[1]。實驗中測得菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶的酶活明顯提高，使得α-酮戊二酸更多的發(fā)生氨基化反應(yīng)形成谷氨酸，進而合成更多的γ-PGA。

γ-PGA合成途徑涉及多種酶類，金屬離子對發(fā)酵過程有重要作用。于B.licheniformisNCIMB 11709、B.subtilisNX-2發(fā)酵液中添加不同濃度Mn2+，可獲得不同的γ-PGA D-異構(gòu)體[2]。于Bacillus sp.RKY3 發(fā)酵液中添加少量 Mg2+或 K+，能激發(fā)細胞生長及增加γ-PGA產(chǎn)量[3]。通常情況下，由于聚合物不斷積累，γ-PGA發(fā)酵液會隨著時間的增加變得非常黏稠，這個現(xiàn)象會嚴(yán)重限制溶氧傳質(zhì)，導(dǎo)致細胞生長緩慢，同時造成γ-PGA產(chǎn)量下降[4]。據(jù)報道，向發(fā)酵液中加入NaCl可以有效減少泡沫、降低黏度，然而NaCl的加入會明顯降低γ-PGA的分子量大小[5]。

本研究從胞內(nèi)調(diào)控角度，研究鈣離子是否調(diào)控了編碼α-酮戊二酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進而使酶活性增加，聚谷氨酸產(chǎn)量提高。期望這一研究結(jié)果能夠為進一步提高γ-PGA合成水平提供人為控制的技術(shù)策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（1）菌株納豆芽孢桿菌 Bacillus subtilisnatto HSF 1410。（2）試劑Trizol，購自上海生工生物有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、熒光定量試劑 SYBR? Premix Ex Taq?，購自Takara公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

（3）實時定量 PCR 儀（PikoReal real-time PCR system美國Thermo公司）；微量核酸蛋白測定儀（Nanodrop ND 2000型美國Thermo公司）；高速離心機（1-14型Sigma公司）；電泳儀（DYY-6C型北京市六一儀器廠）；培清JS-680B全自動凝膠成像分析儀（JS-680B型上海培清科技有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9080MBE型山海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

（4）引物實驗選用gapdh作為內(nèi)參基因。采用Primer5.0軟件對引物進行設(shè)計和分析，內(nèi)參基因gapdh引物序列 P1：TTCCGCACAAAGACTACCG；P2：AACACGCATTGCTCCACC。ogdh引物序列P3：AAAAGGGTATCAAGTAGGCGGT；P4：AGCATTGGCTGAGTGGTTGA。引物均在南京金斯瑞生物有限公司合成。

（5）培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20g/L、谷氨酸鈉 10g/L、NH4Cl 1g/L、酵母粉 1g/L、K2HPO43g/L、MgSO40.2g/L，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

（6）100g/LCaCl2儲備液：稱取 10g CaCl2，去離子水定容至100mL，121℃滅菌20min，4℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵菌泥制備

從HSF 1410保藏斜面上刮取一環(huán)菌體接至種子培養(yǎng)基（100mL/500mL），搖床上37℃、150r/min，12～16h得到種子培養(yǎng)液。在5份發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入CaCl2儲備液0、50、100、150μL和200μL，使CaCl2終濃度為0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰和0.2‰。按2%接種量（v/v）將種子培養(yǎng)液分別轉(zhuǎn)接至5份發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、180r/min發(fā)酵24h。將發(fā)酵液稀釋5倍，轉(zhuǎn)移至50mL滅菌離心管，12000r/min、4℃離心10min收集菌體，用等體積預(yù)冷的生理鹽水（含 1mM PMSF，5mM DTT），12000r/min、4℃離心10min清洗菌體3次，得到新鮮菌泥。

1.2.2 總RNA的提取

與RNA接觸的器具均用DEPC水浸泡24h，121℃滅菌30min。菌泥中加入1mL無菌水，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，12000g、4℃離心2min收集菌體，棄上清。在研缽中加入液氮，迅速將含有菌泥的1.5mL離心管底部浸入液氮中速凍，保持液氮浴狀態(tài)，使用一次性組織研磨杵迅速研磨菌體至菌體成粉末狀?？焖偌尤?mL Trizol，用移液器反復(fù)吹吸至裂解液中無明顯沉淀，后續(xù)操作詳見Trizol使用說明書。用微量核酸蛋白測定儀對總RNA進行濃度值及純度檢測；用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行完整度檢測。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA

采用 Takara 公司的 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，操作步驟見說明。所得cDNA立即用于后續(xù)實驗或于-20℃保存。

1.2.4 實時定量PCR

將實時定量PCR反應(yīng)體系加入96微孔板中，空白組以ddH2O代替cDNA加入，每個樣品3個復(fù)孔。加樣順序：SYBR 5μL，上游引物（10μM）0.4μL，下游引物（10μM）0.4μL，cDNA1μL，ddH2O 3.2μL。96孔板用透明膜封好，置于實時定量PCR儀中，按表1所述程序擴增，檢測內(nèi)參及目的基因在樣本中的擴增情況。

表1 實時定量PCR反應(yīng)程序

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA檢測

提取5組不同處理組中菌體總RNA，測得總RNA的OD260/OD280比值均在2.0左右，證明總RNA純度較高。甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，23S及16S條帶清晰完整，總RNA完整性很好。

1，2，3，4，5分別代表發(fā)酵液中CaCl2終濃度為0‰，0.05‰，0.1‰，0.15‰，0.2‰的樣品

2.2 鈣離子對ogdh基因表達的影響

圖2A代表CaCl2分別為0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰時GAPDH基因?qū)崟r定量PCR實驗的擴增曲線及熔解曲線 ；B代表CaCl2分別為0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰時ogdh基因定量PCR實驗的擴增曲線及熔解曲線

圖1 總RNA電泳圖

五個不同濃度鈣離子處理組目的基因ogdh與內(nèi)參基因GAPDH的PCR擴增曲線及溶解曲線見圖2，擴增曲線光滑，熔解曲線峰單一，說明為特異性擴增。

不同濃度鈣離子處理組的ogdh表達水平結(jié)果見圖3。設(shè)定CaCl2濃度為0‰組的ogdh的相對表達量均為1時，可計算出CaCl2分別為0‰、0.05‰、0.1‰、0.15‰、0.2‰時，其ogdh相對表達量之比為：1∶1.672∶2.085∶4.468∶4.518。與CaCl2終濃度為0‰組相比，當(dāng)Ca2+在發(fā)酵培養(yǎng)基中濃度不斷升高時，其ogdh基因表達量也隨之升高。

3 結(jié)論

實驗從調(diào)控生物酶表達水平角度，研究了鈣離子對α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上Ca2+提高了編碼α-酮戊二酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)錄水平，使得酶表達量增加。α-酮戊二酸酶活提高從而加快TCA循環(huán)，促進內(nèi)源谷氨酸合成，最終提高聚谷氨酸產(chǎn)量。

圖2-不同處理組GAPDH月ogdh擴普曲線及溶解曲線

圖3 不同鈣離子濃度下的ogdh相對表達量