牛夏憶 李 淼 張 倩 陳云雨 劉曉平

(皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，蕪湖241002)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異?；罨诟伟⑷橄侔?、結(jié)直腸癌、急慢性淋巴細(xì)胞白血病、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已成為腫瘤靶向治療的重要靶標(biāo)之一[1,2]。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)分子，其核心功能區(qū)包括犰狳蛋白重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域(138-686 aa)蛋白和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(687-781 aa)，主要介導(dǎo)與Wnt信號(hào)通路其他蛋白相互作用和染色質(zhì)重塑復(fù)合體的募集[3]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，β-catenin通過(guò)與Tcf4(T-cell factor 4)和Lef1(lymphoid enhancer factor 1)相互作用而啟動(dòng)大量原癌基因表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[4,5]。另外，Spranger等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)β-catenin可能是黑色素瘤抵抗免疫治療的重要機(jī)制之一，但β-catenin如何在腫瘤微環(huán)境中調(diào)控免疫耐受的分子機(jī)制尚未明確[6,7]。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行人β-catenin(138-781 aa)原核表達(dá)與分離純化，并以此為抗原制備特異性大鼠多克隆抗體(Polyclonal antibody,PcAb)，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒和pET-30a(+)載體由中國(guó)科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授惠贈(zèng)；E.coliDH5α及E.coliRosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、Taq酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、pEASY?-T1試劑盒、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量、BamHⅠ與XhoⅠ購(gòu)自全式金公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo公司；氨芐西林、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)購(gòu)自阿拉丁公司；牛血清白蛋白、小鼠抗組氨酸(Histidine,His)標(biāo)簽單抗、辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和HRP-山羊抗大鼠IgG購(gòu)自Biosharp公司；MaxiLuminTM化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自百智生物公司；四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB)溶液購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；384孔板購(gòu)自PerkinElmer公司；異硫氰酸熒光素(Fluoresc-ence isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的Lef1[FITC-Lef1:FITCGDPELCATDEMIPFKDE]由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；HisTrapTM層析柱購(gòu)自GE公司；Freund完全佐劑和Freund不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；Wistar大鼠購(gòu)自維通利華公司；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 β-catenin(138-781 aa)基因克隆 根據(jù)人β-catenin(138-781 aa)基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物P1：5′-AGGATCCAACTTGATTAACTATCAA-3′；下游引物P2:5′-ACTCGAGCAGGTCAGTATCAAACCA-3′。以GST-β-catenin-pGEX-4T-1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增β-catenin基因片段。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s、進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72℃總延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2 β-catenin原核表達(dá)載體構(gòu)建 β-catenin基因進(jìn)行切膠回收后，以pEASY?-T1試劑盒與T載體連接后，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含100 μg/ml氨芐西林)。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序和BLAST比對(duì)分析。

測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒和pET-30a(+)載體進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將回收的β-catenin基因片段與pET-30a(+)載體以T4DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒β-catenin-pET-30a(+)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選后，挑取單菌落再次進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒雙酶切鑒定。

1.2.3 β-catenin原核表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落接種至5 ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/ml卡那霉素)中，誘導(dǎo)β-catenin表達(dá)(1 mmol/L IPTG，37℃誘導(dǎo)6 h)，以8% SDS-PAGE檢測(cè)。以轉(zhuǎn)化pET-30a(+)質(zhì)粒的E.coliRosetta (DE3)為陰性對(duì)照組。

1.2.4 β-catenin誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 將工程菌接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/ml卡那霉素)中，設(shè)置誘導(dǎo)溫度為30℃，以1.0 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10、12 h。在各時(shí)間點(diǎn)等量收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件進(jìn)行β-catenin表達(dá)量分析。將誘導(dǎo)溫度設(shè)置為25℃和20℃，重復(fù)上述操作。

1.2.5 β-catenin最佳表達(dá)條件確定 等量收集30℃誘導(dǎo)8 h、25℃誘導(dǎo)10 h和20℃誘導(dǎo)10 h的菌體，用適量TBS(50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl pH8.0)重懸后以超聲波法裂解菌體。離心收集裂解后的上清液和沉淀，以8% SDS-PAGE分析β-catenin的可溶表達(dá)。

1.2.6 IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化 工程菌分別以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG，25℃誘導(dǎo)10 h，等量收集菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析不同IPTG誘導(dǎo)濃度條件下β-catenin表達(dá)量。

1.2.7 β-catenin分離純化與鑒定 以確定的最佳表達(dá)條件進(jìn)行工程菌大量培養(yǎng)，收集裂解菌體上清液，以25%飽和硫酸銨溶液沉淀后，用適量A液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L 咪唑 pH7.8)稀釋制備粗提液。將HisTrapTM層析柱用10倍柱床體積的A液進(jìn)行清洗平衡后，以0.5 ml/min流速上樣。最后以B液(25 mmol/L Tris、0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L 咪唑 pH7.8)進(jìn)行梯度洗脫并收集目的蛋白。純化的β-catenin蛋白以8% SDS-PAGE分析，經(jīng)TBS(25 mmol/L Tris、0.15 mol/L NaCl pH8.0)透析后，以BCA法定量。

將含有純化的β-catenin蛋白泳道的電泳膠轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。一抗為小鼠抗His標(biāo)簽單抗(1∶2 000)，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG(1∶4 000)，以MaxiLuminTM化學(xué)發(fā)光液顯影成像。

1.2.8 熒光偏振實(shí)驗(yàn) 參考相關(guān)文獻(xiàn)[8,9]，將80 nmol/L FITC-Lef1(30 μl/孔)依次加入到384孔板中，同時(shí)將β-catenin蛋白以熒光偏振反應(yīng)液(50 mmol/L Tris、10 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA pH8.0)稀釋至1 000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、0 nmol/L。將上述蛋白稀釋液以30 μl/孔依次加入到含有FITC-Lef1的384孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置3組復(fù)孔。室溫避光15 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)毫偏值(millipolarization unit,mP)。以GraphPad Prism軟件擬合結(jié)合曲線(xiàn)并計(jì)算結(jié)合反應(yīng)的解離常數(shù)(Dissociation constant)即Kd值。

1.2.9 抗人β-catenin多克隆抗體的制備 采用參考文獻(xiàn)所述的方法[10]，用β-catenin蛋白作為免疫原，免疫原劑量為200 μg/(只·次)。首次免疫將抗原與等體積Freund完全佐劑充分混合乳化，大鼠皮下注射。間隔3周后進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，將抗原與等體積Freund不完全佐劑充分混合乳化，皮下注射。第二次免疫后的第7 d，大鼠尾尖采血，以ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)?？寡逍r(jià)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)：抗血清效價(jià)≥1∶70 000。如達(dá)到效價(jià)，取全血分離血清備用。

1.2.10 抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)檢測(cè) 將β-catenin蛋白(10 μg/ml；100 μl/孔)包被96孔酶標(biāo)板后，以10%牛血清白蛋白37℃封閉2 h。PBST洗板3次后，加入以2倍倍比稀釋的大鼠抗血清(1∶1 000～1∶1 024 000；100 μl/孔)，每組3個(gè)復(fù)孔，室溫孵育1 h，同時(shí)以動(dòng)物免疫前血清作為陰性對(duì)照組。加入HRP-山羊抗大鼠IgG后，37℃孵育1 h。TMB溶液顯色后，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450值。S/N=OD稀釋抗血清/OD陰性對(duì)照，陽(yáng)性樣品判斷標(biāo)準(zhǔn)為S/N≥3.0。

1.2.11 抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性檢測(cè) 將含有β-catenin蛋白(0.5、1、2 μg)的電泳膠轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot檢測(cè)。一抗為抗人β-catenin多克隆抗體(1∶10 000)，二抗為HRP-羊抗大鼠IgG(1∶5 000)，以MaxiLuminTM化學(xué)發(fā)光液顯影成像。將HeLa、A549、HepG2、HT29、MCF-7和MRC-5細(xì)胞裂解，同法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的內(nèi)源β-catenin。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 以GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒為模板，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出約1 932 bp的特異片段，其與β-catenin基因片段理論大小一致(圖1A)。將β-catenin基因片段與pET-30a(+)載體連接構(gòu)建重組質(zhì)粒β-catenin-pET-30a(+)，隨機(jī)挑取經(jīng)藍(lán)白斑篩選的單菌落進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果表明，所有菌落均可擴(kuò)增出約1 932 bp的特異片段(圖1B)。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，再次得到了約1 932 bp的特異片段(圖1C)。上述結(jié)果表明，成功構(gòu)建了β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒。

2.2 β-catenin原核表達(dá) 6株工程菌以1 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)6 h后，等量收集的菌體進(jìn)行8% SDS-PAGE分析β-catenin原核表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在分子量77 kD處有明顯的蛋白表達(dá)條帶，其與β-catenin理論分子量基本一致(圖2)。這表明成功進(jìn)行了β-catenin原核表達(dá)。

圖1 β-catenin原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of bacterial expression plasmid of human β-catenin proteinNote: A.PCR product of β-catenin gene；M.DNA marker；1.β-catenin gene product；B.PCR products of six random positive clones；M.DNA marker；1-6.β-catenin gene product from β-catenin-pET-30a(+)/E.coli DH5α；C.Dual-restriction enzyme digestion map for β-catenin-pET-30a(+) plasmid；M.DNA marker；1.β-catenin gene product digested with BamHⅠ/XhoⅠ.

圖2 β-catenin原核表達(dá)Fig.2 Bacterial expression of human β-catenin proteinNote: 1.Negative control；M.Protein marker；2-7.Positive clones.

2.3 β-catenin誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化 工程菌經(jīng)不同誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間培養(yǎng)后，離心收集等量菌體，以8% SDS-PAGE和Clinx Image Analysis軟件分析β-catenin表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度為30℃時(shí)，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，此時(shí)β-catenin表達(dá)量約為12.96%并趨于穩(wěn)定(圖3A)；誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h，此時(shí)β-catenin表達(dá)量約為12.83%并趨于穩(wěn)定(圖3B)；誘導(dǎo)溫度為20℃時(shí)，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為12 h，此時(shí)β-catenin表達(dá)量約為12.23%并趨于穩(wěn)定(圖3C)。

圖3 β-catenin誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化Fig.3 Determination of an optimal temperature and dur-ation of induction for human β-catenin protein expressionNote: A,B,C.SDS-PAGE analysis of human β-catenin protein bacterial expression at 30℃ (A),25℃ (B) and 20℃ (C) for 0-12 h；1.Negative control；M.Protein marker；2-8.Total cell proteins (TCP),0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h.

圖4 β-catenin最佳表達(dá)條件確定Fig.4 Determination of an optimal culture condition for human β-catenin protein expression Note: M.Protein marker；1.TCP (30℃)；2.Supernatant (30℃)；3.Pellet (30℃)；4.TCP (25℃)；5.Supernatant (25℃)；6.Pellet (25℃)；7.TCP (20℃)；8.Supernatant (20℃)；9.Pellet (20℃).

2.4 β-catenin最佳表達(dá)條件確定 等量收集30℃誘導(dǎo)8 h、25℃誘導(dǎo)10 h和20℃誘導(dǎo)12 h的菌體，將菌體以超聲波法裂解后，上清液和沉淀以8% SDS-PAGE分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30℃誘導(dǎo)8 h時(shí)，β-catenin大部分以包涵體形式表達(dá)，上清液中的目的蛋白含量較少；25℃誘導(dǎo)10 h和20℃誘導(dǎo)12 h時(shí)，上清液中β-catenin表達(dá)量明顯增多，沉淀中目的蛋白含量減少，β-catenin基本以可溶形式表達(dá)(圖4)。

2.5 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度確定 工程菌以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG于25℃誘導(dǎo)10 h，等量收集菌體以8% SDS-PAGE分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著IPTG誘導(dǎo)濃度的逐漸增加，β-catenin表達(dá)量基本維持在12%左右并趨于穩(wěn)定，IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)β-catenin表達(dá)量影響較小(圖5)。

綜上所述，確定β-catenin最佳表達(dá)條件為0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度，25℃誘導(dǎo)10 h。

2.6 β-catenin分離純化與鑒定 工程菌以確定的最佳表達(dá)條件進(jìn)行大量培養(yǎng)，菌體裂解上清液以25%飽和硫酸銨溶液沉淀后制備粗提液，經(jīng)HisTrapTM層析柱分離純化后，收集的樣品以8% SDS-PAGE進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在分子量77 kD處獲得了純度較高的β-catenin蛋白(圖6A)。用抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明可在相同分子量位置顯現(xiàn)特異條帶，證實(shí)了β-catenin的正確表達(dá)(圖6B)。純化的β-catenin蛋白經(jīng)TBS透析和BCA法定量后，其濃度為1.2 mg/ml。

2.7 β-catenin生物學(xué)活性鑒定 細(xì)胞核內(nèi)β-catenin/Lef1相互作用是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式[1,5]。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]，將FITC-Lef1探針作為轉(zhuǎn)錄因子Lef1的模擬物，以熒光偏振實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-catenin與探針的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著β-catenin蛋白濃度的不斷升高，mP值也逐漸升高并趨于穩(wěn)定，結(jié)合反應(yīng)具有明顯的量效關(guān)系，Kd值約為66.5 nmol/L(圖7)，這表明β-catenin蛋白具有良好的生物學(xué)活性。

圖5 β-catenin最佳IPTG誘導(dǎo)濃度確定Fig.5 Determination of an optimal IPTG concentration for human β-catenin protein expressionNote: M.Protein marker；1.0 mmol/L IPTG；2.0.2 mmol/L IPTG；3.0.4 mmol/L IPTG；4.0.6 mmol/L IPTG；5.0.8 mmol/L IPTG；6.1.0 mmol/L IPTG.

2.8 抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)測(cè)定 用β-catenin蛋白包被酶標(biāo)板，ELISA方法檢測(cè)抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)，以大于陰性血清OD450值3倍的最小稀釋倍數(shù)值作為多克隆抗體的效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果表明，純化的β-catenin蛋白具有良好的免疫原性，制備的抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)為 1∶128 000(圖8)。

圖6 β-catenin分離純化與鑒定Fig.6 Purification and identification of human β-cate-nin proteinNote: A.Purification of human β-catenin protein；M.Protein marker；1.Precipitated human β-catenin protein by 25% saturated ammonium sulfate solution；2-5.Purified human β-catenin protein；B.Identification of human β-catenin protein by Western blot assay；1.Protein marker；2.Human β-catenin protein band (77 kD).

圖7 β-catenin生物學(xué)活性鑒定Fig.7 Biological activity analysis of purified β-cateninprotein

2.9 抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性測(cè)定 將抗人β-catenin多克隆抗體(1∶10 000)作為一抗，分別與β-catenin蛋白和細(xì)胞內(nèi)源β-catenin反應(yīng)，以Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其抗原特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的β-catenin蛋白與多抗孵育后，在分子量77 kD左右均顯現(xiàn)特異條帶，隨著β-catenin劑量的增多，特異條帶逐漸增粗(圖9A)；6株細(xì)胞裂解液在分子量86 kD位置也呈現(xiàn)出特異條帶(圖9B)。上述結(jié)果說(shuō)明，抗人β-catenin多克隆抗體具有良好的抗原特異性，均能與β-catenin蛋白和細(xì)胞內(nèi)源β-catenin特異結(jié)合。

圖8 ELISA檢測(cè)抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)Fig.8 Analysis of anti-β-catenin polyclonal antibody titer using ELISA

圖9 Western blot實(shí)驗(yàn)鑒定抗人β-catenin多克隆抗體抗原特異性Fig.9 Analysis of immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody by Western blot assayNote: A.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against recombinant β-catenin protein by Western blot assay；1.0.5 μg β-catenin protein；2.1 μg β-catenin protein；3.2 μg β-catenin protein；B.The immunological specificity of anti-β-catenin polyclonal antibody against endogenous β-catenin protein in cancer and normal cells by Western blot assay；1.HeLa cell；2.A549 cell；3.HepG2 cell；4.HT29 cell；5.MCF-7 cell；6.MRC-5 cell.GAPDH was used as the loading control.

3 討論

β-catenin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(β-catenin responsive transcription,CRT)作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心調(diào)控方式，廣泛參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移與腫瘤干細(xì)胞休眠體形成，促進(jìn)腫瘤耐藥與復(fù)發(fā)，已成為新型高選擇性抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的理想靶標(biāo)之一[1,2,4,5]。深入研究β-catenin在Wnt信號(hào)通路中的調(diào)控功能，尤其是調(diào)控腫瘤免疫耐受的分子機(jī)制研究，對(duì)未來(lái)腫瘤免疫治療具有重要意義[7]?？贵w是蛋白功能研究的重要工具，但目前針對(duì)抗人β-catenin多克隆抗體制備國(guó)內(nèi)還未有相關(guān)報(bào)道。特異性抗人β-catenin多克隆抗體制備對(duì)深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的生物學(xué)功能具有重要意義。

多克隆抗體制備具有操作簡(jiǎn)單、制備周期短和特異性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為抗體制備的重要方法。很多研究者采用大腸桿菌原核表達(dá)重組蛋白，將其作為抗原免疫大鼠、小鼠或新西蘭白兔后成功制備了多種高特異性多克隆抗體用于蛋白功能研究[10,12-15]。由于His標(biāo)簽分子量較小，幾乎不影響目的蛋白的理化性質(zhì)，且方便重組蛋白的純化和檢測(cè)[16,17]，故此本研究采用pET-30a(+)載體的His標(biāo)簽融合表達(dá)策略進(jìn)行了人β-catenin核心功能結(jié)構(gòu)域(138-781 aa)的原核表達(dá)。與已報(bào)道的GST-β-catenin-His雙標(biāo)簽融合表達(dá)策略相比[18,19]，本研究建立的人β-catenin原核表達(dá)策略具有更好的簡(jiǎn)便性、實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性。

鑒于誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間是影響外源基因在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的重要因素[20]，我們通過(guò)原核表達(dá)優(yōu)化以提高目的蛋白表達(dá)量和促進(jìn)可溶表達(dá)。β-catenin原核表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度和時(shí)間對(duì)β-catenin的表達(dá)量有重要影響。30℃誘導(dǎo)8 h時(shí)，β-catenin易于形成包涵體；25℃和20℃低溫誘導(dǎo)過(guò)夜則使β-catenin包涵體量減少，促進(jìn)了其可溶表達(dá)，這可能與低溫可減慢蛋白的表達(dá)速率并有利于蛋白質(zhì)正確折疊有關(guān)[20]。另外，我們發(fā)現(xiàn)IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)β-catenin表達(dá)量影響不大，低濃度的IPTG即可誘導(dǎo)β-catenin大量表達(dá)。

熒光偏振技術(shù)(Fluorescence polarization,FP)主要基于偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)的檢測(cè)原理，被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、疾病診斷及大分子活性鑒定[8,9,21,22]。我們以FITC-Lef1探針作為轉(zhuǎn)錄因子Lef1的模擬物，應(yīng)用FP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了β-catenin蛋白能與FITC-Lef1特異結(jié)合，Kd值約為66.5 nmol/L。這表明制備的β-catenin蛋白具有良好的生物學(xué)活性。

利用純化的β-catenin蛋白作為抗原免疫大鼠制備多克隆抗體，以ELISA實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了抗體效價(jià)和抗原特異性檢測(cè)。ELISA實(shí)驗(yàn)表明，制備的抗人β-catenin多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶128 000。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示多抗不僅能特異識(shí)別β-catenin重組蛋白，還能與細(xì)胞內(nèi)源β-catenin特異結(jié)合，這表明制備的抗人β-catenin多克隆抗體具有良好的抗原特異性。另外，我們發(fā)現(xiàn)β-catenin蛋白在大部分腫瘤細(xì)胞中呈高水平表達(dá)，在正常細(xì)胞中則呈低水平表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行了人β-catenin蛋白原核表達(dá)優(yōu)化、特異性多克隆抗體的制備與鑒定，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的生物學(xué)功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝：衷心感謝中國(guó)科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能?chē)?guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室李霓副研究員在β-catenin原核表達(dá)方面給予的悉心指導(dǎo)和無(wú)私幫助！