吳仁協(xié)，翟 云，肖 瑤，牛素芳，張浩冉，黎 曉，陳偉勇

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江524088）

黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）隸屬于鱸形目、鯛科、棘鯛屬（Acanthopagrus），是廣泛分布于印度—西太平洋近海的暖水性中下層經(jīng)濟(jì)魚類［1］。在我國(guó)，黃鰭棘鯛主要分布于東南沿海，其肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，已成為我國(guó)海水魚類的重要養(yǎng)殖對(duì)象［2］。自上世紀(jì)90年代以來(lái)，由于過(guò)度捕撈、近海環(huán)境惡化以及近親繁殖等原因，黃鰭棘鯛自然資源嚴(yán)重衰退，其種質(zhì)資源出現(xiàn)明顯退化［3-4］。為了恢復(fù)與保護(hù)黃鰭棘鯛種質(zhì)資源，各國(guó)政府實(shí)施了一系列漁業(yè)管理措施。比如澳大利亞政府削減漁業(yè)資格撈捕證的頒布數(shù)量，以期控制黃鰭棘鯛的資源捕撈量［5］；日本政府在重要沿海口岸實(shí)施黃鰭棘鯛苗種增殖放流；在我國(guó)東南沿海常年大量放流黃鰭棘鯛魚苗［6］。目前，有關(guān)黃鰭棘鯛的生物學(xué)、養(yǎng)殖技術(shù)、人工育苗等方面已有廣泛的研究報(bào)道［7-8］。但是，關(guān)于黃鰭棘鯛種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道較少［4］，這與缺乏大批量的高多態(tài)性分子標(biāo)記有關(guān)，難以對(duì)其種質(zhì)資源現(xiàn)狀做出精確的遺傳學(xué)評(píng)估。

微衛(wèi)星序列（Microsatellites DNA）是由中間高度變異的核心序列和兩旁相對(duì)保守的側(cè)翼序列組成，廣泛存在于各類真核生物基因組中，分布均勻且高多態(tài)性、呈孟德爾共顯性遺傳特性，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物種質(zhì)資源研究最為常用的第二代分子標(biāo)記［9-10］。關(guān)于黃鰭棘鯛的微衛(wèi)星標(biāo)記，已有學(xué)者采用傳統(tǒng)的富集文庫(kù)法共開發(fā)了24個(gè)二堿基重復(fù)的微衛(wèi)星標(biāo)記［11-13］，并顯示出較高的多態(tài)性。然而，二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)在PCR擴(kuò)增中容易因“滑動(dòng)鏈錯(cuò)配”產(chǎn)生影子帶而導(dǎo)致分型結(jié)果錯(cuò)誤［14］。此外，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)方法比如富集文庫(kù)法、基因組DNA文庫(kù)篩選法等，存在開發(fā)過(guò)程繁雜、成本高昂、效率較低等缺點(diǎn)，通常一次只能篩選幾個(gè)或十幾個(gè)可用位點(diǎn)［15］。因此，有必要借助高通量測(cè)序平臺(tái)來(lái)識(shí)別和篩選出大批量、多堿基重復(fù)的黃鰭棘鯛微衛(wèi)星位點(diǎn)，以促進(jìn)其種群遺傳背景調(diào)查、種質(zhì)資源評(píng)估和分子標(biāo)記輔助育種等相關(guān)研究。

SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment sequencing）是一種通過(guò)酶切、構(gòu)建SLAF文庫(kù)和高通量測(cè)序來(lái)快速獲取樣品基因組DNA中SLAF標(biāo)簽序列的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)［16］。SLAF-seq技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)成本低、開發(fā)周期短、獲取標(biāo)記數(shù)量和類型豐富等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效且經(jīng)濟(jì)的分子標(biāo)記開發(fā)方法，已成功應(yīng)用于多種魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)［17-20］。鑒于此，本研究采用SLAF-seq技術(shù)來(lái)篩選黃鰭棘鯛基因組DNA中高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，以期為該物種的種質(zhì)資源評(píng)估提供新的有效分子標(biāo)記。同時(shí)，將所開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記在9種鯛科魚類中進(jìn)行跨物種擴(kuò)增，以檢測(cè)開發(fā)標(biāo)記在近緣種中的通用性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

2014年7月，采集廣東雷州珍稀海洋生物國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)（簡(jiǎn)稱雷州保護(hù)區(qū)，下同）和陽(yáng)西縣近岸的32尾野生黃鰭棘鯛用于本研究。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，取魚體背部肌肉，先后在體積分?jǐn)?shù)為75%、85%和95%的酒精中進(jìn)行脫水處理，于-20℃冰箱保存。樣品基因組DNA提取采用蛋白酶-苯酚氯仿法［21］。

1.2 SLAF-seq測(cè)序和微衛(wèi)星引物合成

由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行1個(gè)樣品肌肉樣的高通量測(cè)序，采用SLAF-seq技術(shù)來(lái)篩選黃鰭棘鯛全基因組范圍內(nèi)的微衛(wèi)星位點(diǎn)?；蚪M酶切、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序參見張浩冉等（2018）［18］的研究。采用微衛(wèi)星識(shí)別軟件MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html/）對(duì)所得的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行搜集與統(tǒng)計(jì)，并挑選151個(gè)二至六堿基的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物合成。

1.3 微衛(wèi)星引物篩選、三引物PCR擴(kuò)增和分型檢測(cè)

本研究的151個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物多態(tài)性篩選方法參照張浩冉等的研究［18］。初步篩選出可產(chǎn)生2條及以上特異性等位基因條帶的位點(diǎn)即為多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)Schuelke（2000）報(bào)道的M13標(biāo)記法［22］，對(duì)篩選出的64個(gè)黃鰭棘鯛多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的正向引物5′端添加M13序列，并合成標(biāo)記為FAM或HEX熒光基團(tuán)的M13通用引物，引物修飾和合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。通過(guò)梯度PCR（52～62℃）重新摸索三引物（修飾的正、反向引物和M13通用引物）PCR擴(kuò)增的最適退火溫度（表1）。三引物PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)參照翟云等（2018）的研究［17］，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的等位基因分型檢測(cè)。

1.4 跨物種擴(kuò)增

采用9種鯛科魚類進(jìn)行黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記的跨物種擴(kuò)增檢測(cè)，包括太平洋棘鯛（Acanthopagrus pacificus，4尾，湛江硇洲島近岸）、黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii，6尾，湛江硇洲島和雷州保護(hù)區(qū)近岸）、澳洲棘鯛（Acanthopagrus australis，2尾，湛江硇洲島近岸）、臺(tái)灣棘鯛（Acanthopagrus taiwanensis，1尾，臺(tái)灣島西岸）、平鯛（Rhabdosargus sarba，6尾，湛江硇洲島和雷州保護(hù)區(qū)近岸）、二長(zhǎng)棘梨齒鯛（Evynnis cardinalis，7尾，湛江硇洲島和雷州保護(hù)區(qū)近岸）、真赤鯛（Pagrus major，6尾，湛江硇洲島近岸）、藍(lán)點(diǎn)赤鯛（Pagrus caeruleostictus，2尾，北海近岸）和黃牙鯛（Dentex hypselosomus，5尾，湛江硇洲島近岸）。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)同“1.3”。擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)1條或1條以上的特異性等位基因條帶的微衛(wèi)星標(biāo)記即為具有通用性位點(diǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）等基本遺傳參數(shù)由Cervus 3.0.7軟件計(jì)算［23］，各位點(diǎn)的哈迪-溫伯格平衡（HWE）及連鎖不平衡由GenePop 4.3軟件檢測(cè)［24］。通過(guò)Micro-Checker 2.2.3軟件在Brookfeld-1算法下估算位點(diǎn)的無(wú)效等位基因頻率（Fua）［25］，使用FSTAT 2.9.3軟件分析位點(diǎn)的近交系數(shù)（Fis）。

2 結(jié)果與討論

2.1 SLAF-seq測(cè)序

采用SLAF-seq技術(shù)，通過(guò)簡(jiǎn)化基因組深度水平測(cè)序，共產(chǎn)生2.32 M reads讀長(zhǎng)，其中測(cè)序質(zhì)量值（Q）大于等于30的讀長(zhǎng)占總數(shù)的75.63%，表明大部分堿基測(cè)序出錯(cuò)的概率低于0.10%。將酶切片段長(zhǎng)度在415～514 bp的序列定義為SLAF標(biāo)簽，平均測(cè)序深度為9.13×。過(guò)濾質(zhì)量較差的測(cè)序數(shù)據(jù)后，共獲得137 358個(gè)SLAF標(biāo)簽。

利用MISA共搜索出30 676個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中最多的為單堿基重復(fù)，有14 018個(gè)（占總位點(diǎn)的45.70%，下同）；其次是二堿基重復(fù)，有12 302個(gè)（40.10%）；三堿基重復(fù)和四堿基重復(fù)也有相當(dāng)數(shù)量，分別有2 833個(gè)（9.24%）和1 265個(gè)（4.12%）；五堿基重復(fù)和六堿基重復(fù)數(shù)量則較少，分別僅有222個(gè)（0.72%）和36個(gè)（0.12%）。

2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記篩選和遺傳多樣性參數(shù)

經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)后，在151個(gè)二至六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有64個(gè)顯示出多態(tài)性，其多態(tài)比率為42.38%。這些多態(tài)性引物經(jīng)熒光標(biāo)記修飾后，最終有47對(duì)引物在32個(gè)黃鰭棘鯛基因組DNA中擴(kuò)增出具有特異性且清晰的等位基因條帶（表1），包括17個(gè)二堿基、6個(gè)三堿基、8個(gè)四堿基、10個(gè)五堿基和6個(gè)六堿基重復(fù)位點(diǎn)，引物序列的GenBank登錄號(hào)為MG214909～MG214955。

47個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小為102～374 bp，共檢測(cè)出464個(gè)等位基因，等位基因數(shù)在2（AL6-9）和27（AL2-9）之間（均值為10）。Ho在0.156（AL6-9）和0.938（AL4-11）之間（均值為0.628），He在0.177（AL3-7）和0.963（AL2-9）之間（均值為0.741）。47個(gè)位點(diǎn)的PIC平均值為0.705，有44個(gè)位點(diǎn)的PIC值均大于0.250，僅3個(gè)位點(diǎn)（AL3-7、AL3-11、AL6-9）的PIC值小于0.250，表明大多數(shù)位點(diǎn)顯示出較高的多態(tài)性。經(jīng)Bonferroni校正后（校正p＜0.001 1），有4個(gè)位點(diǎn)（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏離HWE并顯示較高的Fis值（分別為0.415、0.455、0.509、0.293）和Fua值（分別為0.163、0.212、0.221、0.128）；其余43個(gè)位點(diǎn)均符合HWE檢驗(yàn)，且各位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡。

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記跨物種擴(kuò)增檢測(cè)

有31個(gè)黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記可在1種或1種以上鯛科魚類中有效擴(kuò)增出特異性條帶（表2）。其中AL2-1、AL2-8、AL3-1、AL4-1分別可在9、8、7、6種鯛科魚類中擴(kuò)增，AL2-4、AL2-9、AL2-17、AL6-7等4個(gè)位點(diǎn)可在4個(gè)物種中擴(kuò)增，AL2-2、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL3-7、AL3-9、AL4-5、AL4-11、AL4-12、AL5-3、AL6-3、AL6-6等12個(gè)位點(diǎn)可在3個(gè)物種中擴(kuò)增，AL2-5、AL3-11、AL4-2、AL4-4、AL6-2等5個(gè)位點(diǎn)可在2個(gè)物種中擴(kuò)增，AL2-13、AL2-19、AL4-8、AL5-6、AL5-8、AL6-1等6個(gè)位點(diǎn)只在1個(gè)物種中擴(kuò)增。

從表2可以看出，31個(gè)黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記在太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中的擴(kuò)增成功率較高，分別為63.8%（26個(gè)位點(diǎn)）、51.1%（24個(gè)位點(diǎn)）和48.9%（23個(gè)位點(diǎn)）；在平鯛、二長(zhǎng)棘梨齒鯛、真赤鯛、藍(lán)點(diǎn)赤鯛和黃牙鯛的擴(kuò)增成功率相對(duì)較低，在前兩者中分別為14.9%（7個(gè)位點(diǎn)）和10.6%（5個(gè)位點(diǎn)），在后三者中均為8.5%（均為4個(gè)位點(diǎn)）；意外的是在臺(tái)灣棘鯛中的擴(kuò)增成功率最低，僅為2.1%（1個(gè)位點(diǎn)）。在標(biāo)記通用性方面，有17個(gè)黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記（AL2-1、AL2-8、AL2-9、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL2-17、AL3-1、AL3-7、AL3-9、AL4-1、AL4-5、AL4-11、AL5-3、AL6-3、AL6-6、AL6-7）在太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中均可擴(kuò)增，而只有3個(gè)標(biāo)記（AL2-1、AL2-8、AL3-1）可在二長(zhǎng)棘梨齒鯛、真赤鯛、藍(lán)點(diǎn)赤鯛及黃牙鯛中擴(kuò)增。

表1 黃鰭棘鯛47個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記信息及其遺傳參數(shù)Tab.1 Information and genetic indices of 47 polymorphic microsatellite markers of Acanthopagrus latus

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 黃鰭棘鯛31個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在9種鯛科近緣種中的跨物種擴(kuò)增Tab.2 Cross-species amplifications of the 31 microsatellite markers of Acanthopagrus latus in 9 relative species of family Sparidae

續(xù)表2

2.4 討論

2.4.1 SLAF-seq技術(shù)開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的優(yōu)勢(shì) Xia等 （2006）、夏軍紅等（2007）、Ahmad-Syazni等（2012）采用磁珠富集法構(gòu)建黃鰭棘鯛基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)分別獲得了58、41、33個(gè)二堿基重復(fù)的微衛(wèi)星序列，而后分別只開發(fā)出11、3、10個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記［11-13］。本研究基于SLAF-seq技術(shù)識(shí)別出黃鰭棘鯛16 658個(gè)二至六堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)，在挑選的151個(gè)位點(diǎn)中成功開發(fā)出47個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，其位點(diǎn)識(shí)別數(shù)量和開發(fā)效率比以往的研究報(bào)道提高了上百倍。此外，本研究的微衛(wèi)星位點(diǎn)還包含了采用傳統(tǒng)開發(fā)方法難以獲取的大量多堿基重復(fù)位點(diǎn)（四至六堿基重復(fù)有1 523個(gè)），有效保障了標(biāo)記開發(fā)的數(shù)量要求和標(biāo)記類型的多樣化?？梢姡赟LAF-seq技術(shù)開發(fā)物種微衛(wèi)星標(biāo)記具有明顯的優(yōu)勢(shì)和便利，非常適用于大規(guī)模的分子標(biāo)記開發(fā)［18-19］。同時(shí)，本研究開發(fā)的30個(gè)高多態(tài)性三至六堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記完全不同于已報(bào)道的24個(gè)黃鰭棘鯛二堿基重復(fù)微衛(wèi)星標(biāo)記［11-13］，尤其是24個(gè)多堿基重復(fù)（四至六堿基）的微衛(wèi)星標(biāo)記在等位基因分型中通常比二堿基重復(fù)位點(diǎn)具有更高的準(zhǔn)確性和有效性［9］，可為黃鰭棘鯛種質(zhì)資源評(píng)估提供新的分子標(biāo)記和分析角度。

2.4.2 黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性和HWE偏離 本研究的微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na均值（10）、Ho均值（0.682）和He均值（0.742）均低于Xia等［11］和Ahmad-Syazni等［13］所報(bào)道的黃鰭棘鯛二堿基重復(fù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na均值（分別為17.1、18.1，下同）、Ho均值（0.74、0.867）和He均值（0.91、0.92）。這可能與本研究含有較多的四至六堿基重復(fù)位點(diǎn)（占總位點(diǎn)的51.06%），而之前所開發(fā)的二堿基重復(fù)位點(diǎn)通常比多堿基重復(fù)位點(diǎn)具有更高的遺傳變異有關(guān)［26］。然而，本研究的Ho均值不但高于Dewoody等（2000）統(tǒng)計(jì)的32種魚類微衛(wèi)星標(biāo)記的Ho均值（0.63）［27］，也稍高于花鱸（Lateolabrax maculatus）、帶魚（Trichiurus japonicus）和沙帶魚（Lepturacanthus savala）微衛(wèi)星標(biāo)記的Ho均值（分別為0.674、0.620、0.634）［10，18-19］，表明所開發(fā)的47個(gè)黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記具有較高的多態(tài)性和遺傳變異水平。PIC可反映遺傳標(biāo)記的多態(tài)性程度，當(dāng)PIC≥0.500時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)0.250≤PIC＜0.500時(shí)，為中度多態(tài)位點(diǎn)；當(dāng)PIC＜0.250時(shí)，則為低度多態(tài)位點(diǎn)［28］。本研究的47個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記PIC平均值為0.705，有41個(gè)位點(diǎn)呈高度多態(tài)性，且各位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡。表明所開發(fā)的大部分微衛(wèi)星標(biāo)記含有豐富的遺傳變異信息，在黃鰭棘鯛種群遺傳資源研究中具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

經(jīng)過(guò)Bonferroni校正后，本研究有4個(gè)位點(diǎn)（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏離HWE，顯示出雜合子缺失現(xiàn)象。同時(shí)這4個(gè)位點(diǎn)均具有較高的Fis（0.293～0.415）和Fua（0.128～0.221），提示近親交配和無(wú)效等位基因可能是造成這4個(gè)位點(diǎn)偏離HWE的重要原因。此外，隨著人工繁殖技術(shù)不斷成熟和完善，中國(guó)沿海黃鰭棘鯛的養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，增加了養(yǎng)殖群體的逃逸機(jī)會(huì)，同時(shí)近年來(lái)各沿海先后開展了大規(guī)模的增殖放流活動(dòng)，這些人為因素加劇了黃鰭棘鯛種群的生態(tài)遺傳風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致養(yǎng)殖群體與野生群體的種質(zhì)混雜和降低種群遺傳多樣性［7］。因此，種群退化和自然選擇導(dǎo)致本研究4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離HWE的可能性還難以排除［29］，有待于今后進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2.4.3 黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記在鯛科魚類中的通用性 本研究的黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記在同屬的太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中的跨物種擴(kuò)增成功率較高（48.9%～63.8%），其次是在平鯛中（14.9%），而在二長(zhǎng)棘梨齒鯛、真赤鯛、藍(lán)點(diǎn)赤鯛及黃牙鯛中的成功率較低（8.5%～10.6%），表明跨物種擴(kuò)增成功率與物種間遺傳距離有直接的相關(guān)性［30］。基于線粒體COI基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究表明中國(guó)鯛科魚類可分為兩大類群，類群I包括四長(zhǎng)棘鯛屬（Argyrops）、犁齒鯛屬（Evynnis）、赤鯛屬（Pagrus）、牙鯛屬（Dentex）等紅體色種類，類群Ⅱ含平鯛屬（Rhabdosargus）、棘鯛屬等銀灰體色種類［31］?？梢?，除了棘鯛屬外，黃鰭棘鯛與平鯛屬的親緣關(guān)系更近于它與其他鯛科魚類。這種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與本研究的跨物種擴(kuò)增結(jié)果相對(duì)應(yīng)。同時(shí)，本研究的跨物種擴(kuò)增結(jié)果也從核基因方面進(jìn)一步支持了中國(guó)鯛科魚類屬間的系統(tǒng)劃分［31］。值得注意的是，黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記在臺(tái)灣棘鯛中的跨物種擴(kuò)增成功率（2.1%）遠(yuǎn)低于棘鯛屬和其他鯛科魚類，僅有1個(gè)位點(diǎn)具有通用性。這可能與臺(tái)灣棘鯛可檢測(cè)樣品數(shù)量少（僅1尾）且基因組DNA質(zhì)量不佳有關(guān)，難以擴(kuò)增出清晰的微衛(wèi)星條帶，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。

除臺(tái)灣棘鯛外，本研究的跨物種擴(kuò)增成功率（平均值為26.85%）低于帶魚和沙帶魚的微衛(wèi)星標(biāo)記在6種帶魚科魚類中的跨物種擴(kuò)增成功率（平均值分別為33.86%和41.43%）［18-19］，但大于花鱸在10種尖吻鱸科和鮨科魚類中的跨物種擴(kuò)增成功率（3.8%～15.4%）［10］，這可能與研究所檢測(cè)的種類數(shù)量有關(guān)，也可能與不同科的屬、種間的遺傳分化程度有關(guān)。此外，本研究有17個(gè)標(biāo)記在棘鯛屬（除臺(tái)灣棘鯛）中能有效擴(kuò)增，說(shuō)明這些標(biāo)記具有較好的通用性，可以適用于該屬魚類的系統(tǒng)進(jìn)化和種群遺傳學(xué)分析。但只有3個(gè)標(biāo)記可在二長(zhǎng)棘梨齒鯛、真赤鯛、藍(lán)點(diǎn)赤鯛及黃牙鯛中有效擴(kuò)增，難以滿足后續(xù)種質(zhì)資源評(píng)估對(duì)分子標(biāo)記數(shù)量的要求。

3 結(jié)論

基于SLAF-seq技術(shù)，本研究在識(shí)別出大量微衛(wèi)星位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，成功開發(fā)出47個(gè)二至六堿基重復(fù)的多態(tài)性黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標(biāo)記，為該物種的種質(zhì)資源評(píng)估和種群遺傳分析提供了新的有效分子標(biāo)記。本研究的開發(fā)方法為其他魚類的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選提供了可靠的方法參考和經(jīng)驗(yàn)借鑒。同時(shí)，17個(gè)開發(fā)標(biāo)記在棘鯛屬中具有較好的通用性，可為該屬魚類的分子系統(tǒng)進(jìn)化研究提供新的標(biāo)記來(lái)源和研究角度。