李明顯 周 娜 何青蓮 鄭廣娟 杜曉華 謝興意 馮 兵

廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(廣東省中醫(yī)院)，廣東省廣州市 510120

免疫組化技術(shù)[1]在病理診斷中的作用十分重要，免疫染色結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性依賴(lài)于免疫組化對(duì)照的設(shè)置[2]。組織芯片是將數(shù)十個(gè)甚至上千個(gè)組織標(biāo)本規(guī)則有序地排布于一張載玻片上，進(jìn)行同一指標(biāo)檢測(cè)的原位組織學(xué)研究技術(shù)，具有容量大、高效率、低消耗、定位準(zhǔn)確等諸多優(yōu)點(diǎn)，適用于免疫組化的質(zhì)量控制及室間評(píng)價(jià)。但是，由于組織芯片制作技術(shù)的完善離不開(kāi)專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備和種類(lèi)豐富的組織標(biāo)本，再者，商品化的組織芯片價(jià)格較高[3]，這些因素都阻礙了基層醫(yī)院免疫組化質(zhì)量控制方面的發(fā)展。為了尋找抗原標(biāo)記物表達(dá)較廣泛的組織以滿(mǎn)足日常工作中免疫組化質(zhì)量控制的要求，筆者對(duì)臨床常見(jiàn)且富含多種組織成分的闌尾組織進(jìn)行了相關(guān)的免疫組化染色。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選取廣東省中醫(yī)院2018年5—10月進(jìn)行闌尾切除并診斷為慢性闌尾炎、急性單純性闌尾炎、急性化膿性闌尾炎和急性壞疽性闌尾炎患者各15例，所有患者術(shù)前均無(wú)腫瘤及免疫疾病相關(guān)病史，診斷報(bào)告由兩位主治以上醫(yī)師簽發(fā)。

1.2 儀器設(shè)備 ES全自動(dòng)封閉式組織處理儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，BENCHMARK@XT全自動(dòng)免疫組化儀購(gòu)自美國(guó)Roche公司，即用型抗體購(gòu)自泉暉、邁新、中杉金橋、基因等生物公司。

1.3 方法 闌尾組織10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，依次連續(xù)切片，每張玻片上均設(shè)立相應(yīng)陽(yáng)性質(zhì)控對(duì)照組織，68℃烤片1h，免疫組化采用SP法，實(shí)驗(yàn)操作步驟均嚴(yán)格按照全自動(dòng)免疫組化儀的設(shè)定程序，染色結(jié)果由2位主治醫(yī)師判讀。

2 結(jié)果

慢性闌尾炎、急性單純性闌尾炎、急性化膿性闌尾炎和急性壞疽性闌尾炎組織中抗體染色陽(yáng)性種類(lèi)平均分別為104種、82種、65種、46種。慢性闌尾炎組織中的抗體染色陽(yáng)性種類(lèi)均穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)的種類(lèi)范圍涵蓋了其余3種急性闌尾炎組織中抗體染色陽(yáng)性的所有種類(lèi)，圖1。實(shí)驗(yàn)中慢性闌尾炎組織抗體染色陽(yáng)性的具體情況匯總?cè)缦拢?/p>

ATRX、Calretinin、CK、CK7、CK8、CK18、CK19、CK20、CK-LMW、CEA、E-Cadherin、EMA、CDX-2、Villin、β-catenin表達(dá)于腺上皮細(xì)胞；BCL-2、BLC-6、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD10、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD30、CD35、CD38、CD43、CD45、CD45RO、CD57、CD61、CD68、CD75、CD79a、CD99、CD117、CD138、CD163、CD207、CDK4、C-MYC、CyclinD1、CXCL13、FLI-1、Galectin-3、IgG、IgG4、INI-1、Ki67、kappa、Lammda、MAC387、MLH1、MSH2、MSH6、MUM-1、P120、PAX5、PAX8、PD-1、PMS2、SOX-11、TIA-1表達(dá)于黏膜下層淋巴組織細(xì)胞；CD31、CD34、D2-40、ERG、FactorⅧ、VEGF表達(dá)于血管及淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞；AAT、AACT、CD68、CollagenⅣ、Lyosozyme、Mac387、Vimentin表達(dá)于黏膜下層的組織細(xì)胞；Caldesmon、Calponin、Desmin、HHF35、MSA、SMA、SMMHC表達(dá)于肌層平滑肌細(xì)胞；CD56、CgA、NF、NSE、Syn、S-100表達(dá)于肌層神經(jīng)纖維細(xì)胞；CK(H)、CK5、CK5/6、MC表達(dá)于闌尾漿膜。

圖1 慢性闌尾炎不同組織結(jié)構(gòu)的免疫表達(dá)

A.S-100神經(jīng)細(xì)胞胞漿陽(yáng)性 20×；B.MSA肌型細(xì)胞胞漿陽(yáng)性 20×；C.CD7增生反應(yīng)性T細(xì)胞細(xì)胞膜陽(yáng)性 20×；D.CEA腺上皮胞漿陽(yáng)性 20×。

3 討論

免疫組織化學(xué)技術(shù)已成為病理診斷中必不可少的輔助工具，近年出現(xiàn)的組織芯片技術(shù)通過(guò)科學(xué)合理的設(shè)計(jì)使得大規(guī)模的免疫組化質(zhì)量控制工作變得簡(jiǎn)便易行，但組織芯片技術(shù)在開(kāi)展過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題。首先，組織取材的大小及取樣深度[4]能否真實(shí)反映異質(zhì)性腫瘤的全部信息是芯片設(shè)計(jì)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題；組織固定、處理時(shí)間、包埋條件及自身硬度的差別也會(huì)影響組織芯片的制作質(zhì)量；組織芯片的組織來(lái)源尤其是少見(jiàn)或罕見(jiàn)的組織標(biāo)本收集十分困難，因此組織芯片技術(shù)的推廣應(yīng)用具有一定的難度。

闌尾炎是一種臨床常見(jiàn)病，根據(jù)病程常分為慢性闌尾炎和急性闌尾炎，急性闌尾炎包括急性單純性闌尾炎、急性化膿性闌尾炎、急性壞疽闌尾炎三種主要類(lèi)型，手術(shù)摘除的闌尾組織是病理科常見(jiàn)的病理標(biāo)本。闌尾由上皮組織、黏膜下層、肌層組織和淋巴組織四部分組成，含有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)等不同胚層發(fā)育而來(lái)的各種組織[5]，能夠表達(dá)多種抗原，可作為質(zhì)控對(duì)照組織用于大部分常用抗體的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較不同類(lèi)型的闌尾炎組織，發(fā)現(xiàn)抗體染色陽(yáng)性的穩(wěn)定表達(dá)及表達(dá)種類(lèi)與患者的性別和年齡無(wú)關(guān)，而與闌尾組織的壞死程度相關(guān)。慢性闌尾炎組織因無(wú)壞死成分，抗體染色陽(yáng)性的種類(lèi)具有一致性，均為104種；而急性闌尾炎組織由于發(fā)生了不同程度的壞死，以間皮、腺上皮細(xì)胞及黏膜下淋巴組織影響最嚴(yán)重，抗體染色陽(yáng)性的種類(lèi)均少于慢性闌尾炎組織，即使同一類(lèi)型的急性闌尾炎組織抗體染色陽(yáng)性的種類(lèi)因壞死程度的不同而存在一定差異，因此慢性闌尾炎組織可以作為一種簡(jiǎn)易而又高效穩(wěn)定表達(dá)的質(zhì)控對(duì)照組織。在確認(rèn)將慢性闌尾炎組織作為合格的質(zhì)控對(duì)照組織前需進(jìn)行HE染色觀(guān)察判斷，以保證所選的組織包含上皮組織、黏膜下層、肌層組織和淋巴組織，而且包含至少1個(gè)淋巴濾泡。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)闌尾組織管徑≥1cm時(shí)，沿組織切面的直徑切開(kāi)可以得到兩個(gè)合格的質(zhì)控對(duì)照組織[6]。因此可以將闌尾組織與其他類(lèi)型的組織進(jìn)行組合，以進(jìn)一步擴(kuò)大新型組合的組織芯片的免疫表達(dá)種類(lèi)，為免疫組化質(zhì)量控制工作帶來(lái)更多方便。在實(shí)際工作應(yīng)用中尚需要注意以下幾點(diǎn)：(1)需在病理報(bào)告工作完成后再對(duì)闌尾組織進(jìn)行質(zhì)控對(duì)照實(shí)驗(yàn)，同時(shí)盡量避開(kāi)含糞石的組織或清洗干凈，以便于切片制作。(2)闌尾組織每次制備200張組織切片后都應(yīng)將最后一張切片進(jìn)行HE染色，以確定制備的質(zhì)控對(duì)照切片合格和剩余組織結(jié)構(gòu)的完整性及變化趨勢(shì)，為下次質(zhì)控對(duì)照工作做好隨時(shí)調(diào)整的準(zhǔn)備。(3)質(zhì)控對(duì)照切片制備數(shù)量以滿(mǎn)足1周的工作量需求為宜，且需放置在4℃冰箱保存[6]。(4)定期更換新鮮固定液，24～48h后再進(jìn)行脫水處理，以防止固定不足影響抗體染色的穩(wěn)定表達(dá)。

總之，慢性闌尾炎組織可表達(dá)種類(lèi)廣泛的抗原，與組織芯片相比，具有組織來(lái)源豐富、制作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)，因此利用闌尾組織制作免疫組化的質(zhì)控對(duì)照是一種簡(jiǎn)單實(shí)用而又高效的方法，不但適用于基層醫(yī)院，其他醫(yī)院也可以參考借鑒，值得推廣。