劉 艷 黃傳書 趙 珮 雷 霆 宋志光 邢康康

(1.重慶市蠶業(yè)科學技術研究院，重慶400700；2.重慶市中藥研究院，重慶400065)

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，作為中藥入藥已有2000多年的歷史，在《本草綱目》《神農本草經》《中藥大辭典》中均有詳細記載，是中國最有發(fā)展前景的藥用真菌之一，有“森林黃金”之美稱[1]?，F(xiàn)代研究表明，桑黃具有抗癌、抗腫瘤、保肝、降血糖、免疫調節(jié)等作用。桑黃因其多糖能顯著抑制腫瘤生長和轉移，且對人體不良反應小，是目前國際公認的生物治癌領域中效率最高的真菌。目前桑黃菌種包括鮑氏針層孔菌(phellinusbaumii)、火木針層孔菌(phellinusigniarius)、裂蹄針層孔菌(phellinuslinteus)、瓦寧纖孔菌(Inonotusvaninii)[2-6]。市場上供應的主要有桑樹桑黃、楊樹桑黃、暴馬丁香桑黃、樺樹桑黃、松樹桑黃等。桑樹桑黃的多糖、 黃酮和三萜類含量均高于其他樹種，因此桑樹桑黃為極品，價格最高[7-9]。隨著人們健康意識不斷提高，對高品質桑黃產品需求逐漸增大，目前野生桑黃資源匱乏，遠不能滿足人們對高品質桑黃的需求。因此人工栽培桑樹桑黃具有廣闊的市場前景，進行適宜桑樹桑黃菌種篩選及人工繁育技術研究，對桑樹桑黃規(guī)?；彤a業(yè)化十分重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌種

桑黃菌株1、2、3、4號，來源于金寨尚臻生物科技有限公司。

1.1.2 代料配方原料

桑樹木屑、玉米粉、稻皮、棉籽殼、熟石膏。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制作方法

1.2.1.1 母種培養(yǎng)基

(1)配料：葡萄糖20g、瓊脂20g、鮮馬鈴薯200g、磷酸二氫鉀2g、硫酸鎂1g、水1000mL。

(2)制作方法：將鮮馬鈴薯稱量水煮攪碎過濾去渣，再與上述其他配料均勻混合，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、121℃條件下，滅菌20min。

1.2.1.2 原種培養(yǎng)基

(1)配料：主料按桑樹木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占總質量55%。

(2)制作方法：將上述配料混合均勻，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、123℃條件下，滅菌50min。

1.2.1.3 栽培種培養(yǎng)基

(1)配料：主料按桑樹木屑78%、稻皮20%、石膏粉2%，水分占總質量55%，pH值控制在6～7。

(2)制作方法：將上述配料混合均勻，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、121℃條件下，滅菌50min。

1.2.2 菌種培養(yǎng)方法

1.2.2.1 母種培養(yǎng)

將桑黃菌株1、2、3、4號分別接種到母種培養(yǎng)基斜面中，在溫度25℃、濕度65%條件下，避光培養(yǎng)7～10d，菌絲長滿斜面培養(yǎng)基。

1.2.2.2 原種培養(yǎng)

將上述母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，放入人工氣候箱中，在溫度25℃、濕度65%條件下，避光培養(yǎng)，隔天觀察，記錄菌絲粗細及顏色變化情況，菌袋長滿的時間。

1.2.3 適宜桑樹桑黃菌株的篩選鑒定

1.2.3.1 適宜桑樹桑黃菌株篩選

桑黃菌株1、2、3、4號的母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，在相同條件下培養(yǎng)至菌絲長滿菌袋，觀察菌絲顏色變化、粗細、生長速度，篩選適宜菌株。

1.2.3.2 適宜桑樹桑黃菌株鑒定

(1)形態(tài)鑒定

將適宜桑樹桑黃菌株接種到含有母種培養(yǎng)基的平皿，在溫度25℃，濕度65%條件下，避光培養(yǎng)7d左右，觀察菌落形態(tài)。

(2)rDNA ITS分子鑒定[10]

將適宜桑樹桑黃菌株抽提DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA抽提結果。設計ITS序列引物，將抽提的DNA進行PCR擴增。產物純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。獲得的序列經進行BLAST比對，結合形態(tài)學特征，確定分離菌種的分類地位。

(3)DNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

將測序獲得的ITS序列通過BLAST比對，根據(jù)同源性相似度差異，利用Clustal X(Version 1.83)軟件進行多序列匹配排列，用軟件MAFFT version 7，鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對桑黃菌株3號與Genebank數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關系進行分析。

1.2.4 桑黃代料制作

1.2.4.1 桑黃代料配方的篩選

為優(yōu)化桑黃代料配方，本試驗通過參考其他相關研究及預試驗情況，設計桑樹木屑、玉米粉、稻皮、棉籽殼、熟石膏比例范圍分別為：桑樹木屑40%～85%，玉米粉2%～20%，稻皮2%～25%，棉籽殼10%～17%，熟石膏1%～3%(見表1)。在此范圍內設置20組配方，按相同培養(yǎng)條件，觀察分析適宜代料配方。

1.2.4.2 桑黃代料的制備

將篩選物料按照實驗設計的比例混合，加入55%水，裝袋后扎好口，放入高壓蒸汽滅菌鍋，在0.11MPa、123℃條件下，滅菌50min冷卻，將篩選出的適宜桑樹桑黃菌種接入代料，放入人工氣候箱培養(yǎng)，溫度保持28℃，濕度保持60%～75%，桑黃菌絲一般60d左右長滿菌袋。

表1 實驗因素和水平表

1.2.5 桑黃子實體培養(yǎng)

菌絲體長滿栽培袋后，等黃色變棕色時，在顏色最深處割口出黃，出黃溫度30℃～33℃，85%～95%濕度，300lx光照條件下培養(yǎng)30～60d，見子實體生長圈顏色變深開始干燥不再生長時采收。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選

桑黃菌株1、2、3、4號的母種分別接入含有原種培養(yǎng)基的菌袋中，在相同條件下培養(yǎng)至菌絲長滿菌袋，均未出現(xiàn)污染。桑黃菌株1號培養(yǎng)71d菌絲長滿菌袋，顏色淺黃，菌絲較粗；2號培養(yǎng)63d菌絲長滿菌袋，顏色深黃，菌絲較細；3號培養(yǎng)50d菌絲長滿菌袋，顏色深黃，菌絲較粗；4號培養(yǎng)67d菌絲長滿菌袋，顏色淺黃，菌絲較粗。試驗結果表明桑黃菌株3號比其他3種生長速率快、菌絲較粗，更適合用桑樹木屑培養(yǎng)。如表2所示。

表2 四株桑黃菌菌絲生長情況

圖1 瓦寧纖孔菌菌落形態(tài)

2.2 菌株鑒定

如圖1所示，桑黃菌株3號在PDA平板上形成的菌落為圓形，氣生菌絲絨毛狀，星狀放射生長；菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)榈S色、黃色至深褐色。經ITS區(qū)測序，BLAST比對，綜合鑒定結果為瓦寧纖孔菌(Inonotusvaninii)。

2.3 分子系統(tǒng)學分析

根據(jù)桑黃菌株3號測定的ITS序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌種結果，桑黃菌種3號的ITS序列與瓦寧纖孔菌、鮑式木層孔菌相似度均為100%，結合Genebank上的8個桑黃菌種有關序列進行了系統(tǒng)發(fā)育樹構建．分枝統(tǒng)計支持率評估采用Bootstrap法，自展值為1000。由圖1可知，所有序列形成兩個大的分支，分別是纖層孔菌和針層孔菌，而桑黃菌種3號與瓦寧纖孔菌遺傳距離(親緣關系)最近，見圖2。

圖2 桑黃菌種3號系統(tǒng)進化樹

2.4 優(yōu)選代料配方分析

如表3所示，本試驗對20組代料配方進行比較試驗研究。20組均成活，其中平均產量最高、菌絲生長速率最快是第4組，而桑枝木屑含量最高的14組平均產量卻并不是最高，說明桑枝木屑并不是越高越好；第4組玉米粉含量較高，木腐菌瓦寧纖孔菌，不僅以桑枝木屑、稻皮、棉籽殼的纖維素和木質素作為碳源，還可利用玉米粉中的糖類物質。根據(jù)試驗結果推測，玉米粉為瓦寧纖孔菌提供了豐富的維生素、磷、鈣和鐵，有利于桑黃的生長繁育。

表3 優(yōu)化代料配方試驗結果

3 討論

本試驗在桑黃菌株和代料培養(yǎng)配方方面進行了研究。從現(xiàn)有的四種桑黃菌株中，篩選出了以桑枝木屑作為主要營養(yǎng)物質的適宜菌株，經形態(tài)學結合分子生物學鑒定為瓦寧纖孔菌。大多數(shù)文獻集中報道了瓦寧纖孔菌以楊樹作為寄主，而以桑樹作為寄主鮮有報道。設計了20組配方，按照配方比例進行試驗，從中篩選出了最佳配比，即桑樹木屑80%、玉米粉10%、稻皮2%、棉籽殼7%、熟石膏1%。同時試驗表明瓦寧纖孔菌可將玉米粉作為營養(yǎng)物質，推測玉米中的維生素、磷、鈣和鐵可能促進該菌的生長繁育，后續(xù)試驗可做深入研究，以期進一步提高桑樹桑黃的產量，為桑樹桑黃的人工繁育和規(guī)模化栽培提供一定參考。