肖鐘迪,王雅麗,付 凱

(1.大慶油田總醫(yī)院 普外科,黑龍江 大慶163001;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科; 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科)

微小RNA(microRNA,miRNAs)是一類長約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA,通過與靶mRNAs完全或不完全互補配對,導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯,從而在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究表明microRNAs參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的全過程[1,2]但是有關(guān)miR-218在肝癌(HCC)的生物學(xué)功能仍然未知,本研究將通過qRT-PCR方法檢測miR-218在肝癌細胞和肝癌組織的表達情況,以及探索miR-218對肝癌細胞系增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響和具體機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系肝癌細胞系BEL-7402,MHCC97L,MHCC97H,QGY-7703,Huh7,HepG2,和正常肝細胞系THLE-2 購自ATCC公司(ATCC,USA)。所有的細胞系均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。

1.2miR-218模擬物(mimics)和陰性miRNA(miR-NC)購自廣州銳博有限公司(RiboBio,Guangzhou,China)。Hoxa10過表達載體pcDNA3.1-Hoxa10和對照載體pcDNA3.1購自Amspring(長沙,China)。各種細胞系種植到不同孔板中,起始密度約70%左右,細胞過夜之后,利用脂質(zhì)體2000(Thermo Fisher Scientific,USA)進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染過程按照說明書進行。

1.3 肝癌組織標(biāo)本本研究選取2011-2013年大慶油田總醫(yī)院普外科肝癌患者30名,均為漢族,其中男性17名,女性13名,年齡25-68歲。所有的樣本采集均獲得了患者知情同意,檢測完全符合大慶油田總醫(yī)院倫理道德標(biāo)準并通過倫理審查。

1.4 RT-qPCR檢測利用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,USA)提取肝癌組織和肝癌細胞的RNA。TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA,TaqMan microRNA PCR (Thermo Fisher Scientific,USA)檢測miR-218表達情況。miR-218引物為5′-CGGGATCCGACCAGTCGCTGCGGGGCTTTCCTTTGTGCTTGATCTAACC-

ATGTGGTGGAACGATGGAAA-3′和5′-CCCA-

AGCTTTGCAGGAGAGCACGGTGCTTTC CGC-

GGTGCTTGACAGAACCATGTTCCGTTTCCA-

TCGTTC-3,U6作為對照microRNA。結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進行miR-218定量分析,每個樣本至少重復(fù)3次,進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 CCK-8檢測實驗應(yīng)用CCK-8檢測試劑盒進行細胞增殖實驗。約2000個轉(zhuǎn)染細胞種植到96孔板中,細胞孵育在37℃和5%的CO2孵育箱中。0,24,48,72 h孵育之后,每個細胞孔中分別加入10 μl的CCK-8 (Solarbio,中國),再次將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育2 h,最后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度值。每個樣本至少重復(fù)3次,進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 細胞遷移實驗獲取各組轉(zhuǎn)染的細胞并將其重懸到不含小牛血清的DMEM中,1×105細胞孵育到Matrigel凝膠包被的24孔板遷移小室的上層(Corning,USA),下層小室加入500 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h孵育之后,侵襲細胞經(jīng)過4%多聚甲醛固定后,用0.1%結(jié)晶紫進行染色,最后顯微鏡進行計數(shù),拍照并做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 生物信息分析和熒光素酶報告基因?qū)嶒灷蒙镄畔W(xué)方法,應(yīng)用miRWalk,miRanda,TargetScan,miRDB等進行靶基因預(yù)測?？寺oxa10基因野生型(wt)或突變型(mut)的3＇端非編碼區(qū)(3＇UTR),并將其連接到pGL3載體上。將肝癌細胞培養(yǎng)于24孔板中,待細胞生長到50%左右融合時,利用lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染miR-218/miR-NC和pGl3-Hoxa10-wt/mut到肝癌細胞中。48 h后,應(yīng)用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(Promega)進行測量。重復(fù)三次實驗后進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8Western blot RIPA裂解液提取細胞和組織的蛋白,蛋白質(zhì)經(jīng)過定量之后,經(jīng)過12%SDS-PAGE分離之后轉(zhuǎn)染至PDMF membrane (Millipore,USA)。5%脫脂奶阻塞1 h后,加入一抗在4℃過夜,二抗在室溫下孵育2 h。信號使用ECL Plus system (GE Healthcare,UK)檢測。Hoxa10和GAPDH抗體均購自Santa Cruz 公司(Santa Cruz,USA)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0進行t檢驗,數(shù)值用均值和標(biāo)準差表示,P<0.05代表有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218在肝癌組織和肝癌細胞中表達降低利用RT-qPCR檢測了30例肝癌患者miR-218的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織相比,miR-218在肝癌患者中表達明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1A)；同時,我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),與正常肝細胞相比,miR-218在肝癌細胞表達明顯降低,其中MHCC97H肝癌細胞降低最為明顯(見圖1B)。根據(jù)這些結(jié)果,我們在后續(xù)的細胞實驗中,使用的細胞系均為MHCC97H。這些結(jié)果表明miR-218降低可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

A．肝癌組織中miR-218表達.B 肝癌細胞中miR-218表達

2.2 miR-218過表達顯著降低了肝癌細胞的增殖和侵襲通過miR-218 mimics和miR-NC作用在肝癌細胞MHCC97H中,CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn),與miR-NC相比,miR-218過表達顯著降低了肝癌細胞系的增殖(見圖2A)。遷移小室實驗發(fā)現(xiàn),miR-218過表達顯著降低了肝癌細胞系的侵襲(見圖2B)。以上結(jié)果表明,miR-218過表達能夠降低肝癌細胞的增殖和侵襲。

A.CCK-8實驗.B.遷移小室實驗

2.3 Hoxa10可作為miR-218的直接靶點通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Hoxa10可能是miR-218的直接靶點(見圖3A)。熒光報告素酶實驗發(fā)現(xiàn),在肝癌細胞系MHCC97H中,miR-218 mimics能夠顯著減低Hoxa10-wt的熒光素酶活性；而miR-218 mimics卻不能影響Hoxa10-mut的熒光素酶活性(見圖3B)。同時,Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218 mimics能夠顯著降低Hoxa10在肝癌細胞MHCC97H的表達(見圖3C)。這些結(jié)果表明Hoxa10可作為miR-218抑制肝癌的直接靶點。

2.4 過表達Hoxa10部分抵消miR-218對肝癌細胞的抑制作用我們進行了拯救實驗以驗證miR-218通過作用Hoxa10起到抑制肝癌細胞的作用。我們利用pcDNA3.1-Hoxa10轉(zhuǎn)染到肝癌細胞MHCC97H中,CCK-8和遷移小室實驗發(fā)現(xiàn)Hoxa10過表達部分削弱了miR-218表達增高引起的肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明Hoxa10可以作為miR-218的直接靶點抵消miR-218對肝癌細胞的抑制作用。

A.靶點預(yù)測.B.熒光素酶報告基因?qū)嶒?C.Western blot結(jié)果

3 討論

本研究首先利用RT-qPCR檢測了30例肝癌標(biāo)本和肝癌細胞miR-218的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218在肝癌標(biāo)本和肝癌細胞中表達降低；接著,我們進行了肝癌細胞增殖和侵襲實驗,研究發(fā)現(xiàn)miR-218過表達可以顯著降低肝癌細胞的增殖和侵襲；以上結(jié)果表明miR-218可能具有參與肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

接著,為了進一步研究miR-218抑制肝癌的分子機制,我們利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Hoxa10可能是miR-218的直接靶點,并且通過熒光報告素酶實驗進行了驗證；拯救實驗也表明過表達Hoxa10可以部分抵消miR-218對肝癌細胞增殖和侵襲的抑制作用,以上結(jié)果表明,miR-218抑制肝癌細胞增殖和侵襲的主要機制是通過靶向抑制Hoxa10。

在其他的腫瘤研究中,wei[3]等發(fā)現(xiàn)miR-218在透明細胞腎細胞癌中表達降低,其抑制透明細胞腎細胞癌的主要是機制是靶向抑制蛋白磷酸酶2A。Li[4]等研究發(fā)現(xiàn)miR-218在子宮內(nèi)膜癌的表達降低,其抑制子宮內(nèi)膜癌細胞主要通過靶向調(diào)節(jié)ADD2。

A.CCK-8實驗.B.遷移小室實驗

Xuan[5]等在骨肉瘤的研究發(fā)現(xiàn)miR-218表達降低,其抑制骨肉瘤細胞的主要機制是通過下調(diào)E2F2。此外,miR-218在宮頸癌中也表達顯著降低,其抑制宮頸癌生長和轉(zhuǎn)移的主要機制是調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路[6]。

綜上所述,miR-218通過靶向調(diào)節(jié)Hoxa10從而抑制肝癌細胞的增殖和侵襲。后續(xù)有必要進行小鼠肝癌移植瘤模型的研究,從而進一步闡明miR-218參與肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本研究將為靶向miR-218治療肝癌提供了堅實的理論基礎(chǔ)。