(三亞學(xué)院翟明國院士工作站， 海南三亞572000)

0 引言

景區(qū)開發(fā)建設(shè)及游客踩踏等人為活動(dòng)的頻繁干擾會(huì)對(duì)景區(qū)內(nèi)環(huán)境造成顯著影響[1-3]，如景區(qū)開發(fā)及旅游活動(dòng)會(huì)對(duì)旅游地植被、動(dòng)物、土壤環(huán)境產(chǎn)生不同程度的影響[4-7]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)研究方法難以全面分析其自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)特征和多樣性情況，近年來應(yīng)用較廣的Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠利用從土壤樣本中直接獲取的DNA構(gòu)建文庫并測(cè)序，在研究微生物群落結(jié)構(gòu)方面優(yōu)勢(shì)明顯。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境(如：養(yǎng)分、溫度、水分等)關(guān)系密切，土壤利用方式改變會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性相應(yīng)變化?？梢酝ㄟ^對(duì)比細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及時(shí)了解土壤生態(tài)環(huán)境的變化進(jìn)而及時(shí)調(diào)整土地利用方式、保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境。目前，針對(duì)旅游活動(dòng)對(duì)土壤環(huán)境影響方面的研究還比較少，僅有的研究主要集中于對(duì)土壤環(huán)境的宏觀影響方面，旅游活動(dòng)對(duì)土壤微生物的影響研究較為缺乏[8-9]，旅游景區(qū)開發(fā)、游人踩踏等人為干擾對(duì)景區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。

位于虎豹嶺山脈的三亞臨春嶺森林公園于2013年1月開工建設(shè)，并于2014年9月正式建成開園，現(xiàn)在已經(jīng)成為三亞市民和游客最主要的健身旅游活動(dòng)場所之一。本研究選取臨春嶺森林公園為研究對(duì)象，調(diào)查分析不同程度的景區(qū)開發(fā)及人為干擾對(duì)土壤微生物生態(tài)環(huán)境的影響，以期從微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的角度分析旅游干擾活動(dòng)對(duì)土壤微生物的影響，為旅游景區(qū)合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

三亞臨春嶺森林公園(109°31′40″E～109°32′07″E, 18°15′52″N～18°16′35″N)位于三亞市鳳凰路臨春嶺路段北側(cè)，北面與海螺農(nóng)場相接, 山脈呈南北走向，園區(qū)占地面積187 hm2，海拔最高點(diǎn)約195.6 m，氣候類型為熱帶海洋性氣候，年均溫為25.4 ℃，年均降雨量1 500 mm。土質(zhì)類型主要為山地赤紅壤，土壤質(zhì)地較為黏重，山上森林覆蓋率達(dá)65 %，主要由窿緣桉(Eucalytus exserta F.)、大葉相思(Acacia auriculiformis A.)及其他灌木構(gòu)成的人工成熟林[10]。公園建成開園以來每天接待游客超千人，高峰期超5 000人，旅游干擾對(duì)景區(qū)土壤環(huán)境產(chǎn)生一定影響。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

臨春嶺森林公園主景區(qū)從登山平臺(tái)到瞭望塔鋪設(shè)寬2 m左右的石板路作為登山步道供游人行走，石板路兩側(cè)0～3 m定為游人干擾區(qū)，主要栽植低矮灌木和花卉，種植品種主要有蟛蜞菊(Wedeliachinensis(Osbeck.) Merr.)、朱瑾(Hibiscusrosa-sinensisLinn.)、九里香(MurrayaexoticaL.)、金鳳花(Caesalpiniapulcherrima(L.) Sw.)、水鬼蕉(Hymenocallislittoralis(Jacq.) Salisb.)等；外圍10～30 m是景觀綠化區(qū)，以觀賞樹木火焰木(SpathodeacampanulataBeauv.)、翅莢決明(CassiaalataLinn.)等替代原有喬木樹種方式進(jìn)行人工綠化改造；最外圍是人工成熟林區(qū)，以高大喬木窿緣桉和大葉相思為優(yōu)勢(shì)樹種為主，其間分布低矮灌木。

本研究于2017年1月份沿登山步道自登山平臺(tái)向上約200 m長的步道兩側(cè)隨機(jī)取樣，根據(jù)游人活動(dòng)范圍及景區(qū)開發(fā)建設(shè)情況，按照距離登山步道由近及遠(yuǎn)分為游人干擾區(qū)(L1)、景觀綠化區(qū)(L2)、人工成熟林區(qū)(L3)，每個(gè)區(qū)域分別取樣。其中，游人干擾區(qū)(L1)緊挨步道0～3 m[11-12]，主要以人工種植的灌木及花卉為主，游人干擾較明顯；景觀綠化區(qū)(L2)距步道10～30 m，主要以人工種植的觀賞樹木為主，游客有一定干擾影響；人工成熟林區(qū)(L3)距步道100～150 m，主要樹種為窿緣桉及大葉相思。采用隨機(jī)取樣法，每個(gè)取樣區(qū)分別隨機(jī)選取10個(gè)采樣點(diǎn)，去除表層枯枝落葉用土壤取樣器挖取0～15 cm的上層土壤，土樣分別充分混勻后過篩，按照“四分法”對(duì)樣品縮分后分成兩份，一份保存于-20 ℃冰箱并盡快完成細(xì)菌測(cè)序分析，另一份自然風(fēng)干后測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

2.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》[13]，土壤含水量采用烘干法，土壤容重采用環(huán)刀法，土壤pH采用酸度計(jì)法，土壤全碳采用重鉻酸鉀法，土壤全氮采用凱氏定氮法。

2.3 土壤總DNA的提取及rDNA PCR擴(kuò)增

土壤總DNA提取利用土壤DNA提取試劑盒(Power Soil DNA Isolate Kit，美國mobio公司)，提取的總DNA用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。采用土壤細(xì)菌V3～V4區(qū)通用引物(336F: 5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′; 806R: 5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增目的片段。PCR體系反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，富集擴(kuò)增產(chǎn)物，并切膠純化[14]。

2.4 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析處理

擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣東南芯醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行MiSeq文庫構(gòu)建及Illumina測(cè)序。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0)去除過短序列、嵌合體等低質(zhì)量序列，按97 %的序列相似度進(jìn)行歸并及OTUs (Operational taxonomic units)劃分。采用Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)獲取門分類水平分布情況。利用R 3.1.2軟件計(jì)算各樣本(組)共有OTU的數(shù)量，并通過Venn圖直觀地呈現(xiàn)各樣本(組)共有和獨(dú)有OTU所占比例。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化特性分析

本次調(diào)查對(duì)比了三個(gè)區(qū)域土壤理化指標(biāo)，L1區(qū)土壤含水量最高，L2居中，L3含水量最低，可能是由于取樣時(shí)間正值三亞的旱季，降水不足導(dǎo)致自然成熟林區(qū)土壤含水量較低，而游人干擾區(qū)和景觀綠化區(qū)種植了大量人工花卉和綠化樹種人工灌溉頻繁，因此土壤含水量較高；由于受到游人踐踏的影響L1區(qū)的土壤容重明顯高于其他區(qū)域；人工種植的花卉、觀賞樹木能獲得定期人工補(bǔ)充肥料可能是L1區(qū)的全氮、全磷含量顯著高于其他區(qū)域的原因；而碳氮比三個(gè)區(qū)域沒有顯著差異。具體見表1。

表1 不同取樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)差異Tab.1 Chemical properties of soil in three regions

3.2 測(cè)序文庫評(píng)價(jià)

通過Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三個(gè)取樣地的土壤細(xì)菌16s rRNA的V3～V4區(qū)測(cè)序，經(jīng)過序列質(zhì)量優(yōu)化控制后，三個(gè)取樣地共獲得134 713條序列，L1、L2、L3分別得到45 941、42 876、45 896條序列，三個(gè)取樣點(diǎn)的土壤測(cè)序文庫基本達(dá)飽和，圖1顯示三個(gè)樣地的稀釋性曲線均趨于平坦，說明測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

3.3 土壤細(xì)菌群落的韋恩圖分析

如圖2所示，三個(gè)區(qū)域的OTU數(shù)一共為1 936個(gè)。L3區(qū)的OTU數(shù)目最多為1 195個(gè)，L1和L2區(qū)域的OTU數(shù)目接近，分別為955和923個(gè)；其中，L1區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為348個(gè)，L2區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為318個(gè)，L3區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為557個(gè)；三個(gè)樣地的共有OTU數(shù)目為424個(gè)，約占OTU總數(shù)的21.9 %。由此可知，較少被擾動(dòng)的人工成熟林區(qū)土壤細(xì)菌OTU數(shù)量更豐富，而行道旁游人干擾區(qū)和景觀綠化種植區(qū)的土壤微生物豐度略有降低。

圖1 三個(gè)土壤樣品的稀釋曲線
Fig.1 Rarefaction curves of three soil samples

圖2 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌OUT數(shù)量的Venn圖
Fig.2 Venn diagram of OTU number in three regions

3.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

臨春嶺森林公園三個(gè)區(qū)域的土壤共檢測(cè)到13個(gè)細(xì)菌門，三個(gè)區(qū)域共有的細(xì)菌門類為：Proteobacteria變形菌門、Actinobacteria放線菌門、Acidobacteria酸桿菌門、Chloroflexi綠彎菌門、Firmicutes厚壁菌門、Planctomycetes浮霉菌門、Bacteroidetes擬桿菌門、Nitrospirae硝化螺菌門、Verrucomicrobia疣微菌門、Gemmatimonadetes芽單胞菌門。其中，Proteobacteria變形菌門占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，特別是L1區(qū)和L2區(qū)分別占到96.7 %和96.5 %。其中的Latescibacteria和Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌)兩個(gè)細(xì)菌門類為L1區(qū)特有；armatimonadetes為L2區(qū)特有。賀曉凌等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)Latescibacteria是近垃圾池的土壤中特有的門類，并認(rèn)為此微生物門類或許與垃圾降解相關(guān)。Latescibacteria在本研究中為L1區(qū)特有門類，或許進(jìn)一步顯示此細(xì)菌門類與人類活動(dòng)關(guān)系密切。

3.5 土壤細(xì)菌相似度聚類分析

基于Unweighted UniFrac距離對(duì)三個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析(圖4)，結(jié)果顯示，L1和L2高度相似，可聚為一類，說明L1和L2細(xì)菌群落趨同性更高，而L3則距離相對(duì)較遠(yuǎn)。表明旅游干擾區(qū)及人工綠化區(qū)的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似。

圖3 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌門組成
Fig.3 Relative abundances of bacterialphyla in three regions

圖4 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌群落相似性分析
Fig.4 Similarity of bacterial communitystructure between three regions

3.6 土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)差異分析

圖5 三個(gè)區(qū)域土壤OTU主成分分析Fig.5 Principal component analysis of OTU in three regions

對(duì)三個(gè)區(qū)域的土壤細(xì)菌進(jìn)行了PCA分析，由圖5知第一主軸的貢獻(xiàn)率達(dá)到94.83 %，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；第二主軸的貢獻(xiàn)率僅為5.17 %。L1與L2在第一主軸上最為接近，表明相似度更高，而L3與另兩個(gè)區(qū)域土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異更大。

4 討論

土壤細(xì)菌占土壤微生物總量的70 %～90 %，對(duì)土壤的物質(zhì)循環(huán)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，土壤利用方式的改變會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌類群的結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化。旅游開發(fā)改變了土地利用方式，此外游人踐踏等旅游活動(dòng)的干擾增加土壤的壓力、加劇土地磨損，不僅會(huì)降低該地區(qū)動(dòng)植物的數(shù)量和多樣性，也對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生顯著影響。李會(huì)琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)森林土壤變更為茶園土壤后，菌群多樣性指數(shù)以及菌群OTUs都顯著降低。劉光榮[17]研究發(fā)現(xiàn)廬山景區(qū)原始森林區(qū)土壤微生物群落代謝活性最強(qiáng)，而旅游干擾大的區(qū)域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，代謝活性減弱。段青倩等[18]證實(shí)旅游活動(dòng)會(huì)顯著降低五臺(tái)山山地草甸土壤物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化能力，并進(jìn)一步影響五臺(tái)山草甸植被的多樣性及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。旅游活動(dòng)對(duì)張家界森林公園的土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了顯著影響，其中，細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量與旅游活動(dòng)干擾強(qiáng)度顯著相關(guān)，隨著旅游活動(dòng)干擾強(qiáng)度增大，微生物數(shù)量顯著降低[19]。

本研究結(jié)果表明，土壤細(xì)菌的豐度和多樣性整體表現(xiàn)為L3>L2>L1，成熟林區(qū)土壤微生物多樣性最高，而人工林區(qū)和人工綠化區(qū)微生物更相近，與前人的相關(guān)研究結(jié)論一致，進(jìn)一步證明人工景觀綠化及游人干擾會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生一定影響。本次研究結(jié)果顯示三個(gè)區(qū)域土壤微生物種類中變形菌門(Proteobacteria)均占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，變形菌門中包括了大量參與土壤氮、磷、硫和有機(jī)物代謝循環(huán)相關(guān)的細(xì)菌種類。劉洋等[20]通過454 高通量測(cè)序研究黃土高原不同喬木林土壤細(xì)菌群落，結(jié)果顯示4 種喬木林下變形菌門(Proteobacteria)是最主要的優(yōu)勢(shì)菌門。

研究結(jié)果中變形菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他細(xì)菌門類占比相對(duì)較小或許與臨春嶺優(yōu)勢(shì)樹種窿緣桉有關(guān)，窿緣桉根系分泌物及凋落物會(huì)對(duì)林區(qū)土壤細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生影響[21-22]，其釋放的某些化學(xué)物質(zhì)會(huì)抑制林內(nèi)其他植物的生長進(jìn)而導(dǎo)致林區(qū)內(nèi)群落結(jié)構(gòu)簡單[23]。研究結(jié)果也表明三個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)的個(gè)別門類為某個(gè)區(qū)域特有，如Latescibacteria為L1區(qū)獨(dú)有，L1區(qū)距離步道最近，最易受到游人踩踏等影響，其土壤容重顯著高于其他區(qū)域，同時(shí)人工養(yǎng)護(hù)也造成靠近步道的區(qū)域土壤水分和養(yǎng)分含量較高，可能會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這或許表明此細(xì)菌門類與人類活動(dòng)關(guān)系密切[15]。研究結(jié)果進(jìn)一步證明旅游活動(dòng)及人工綠化改造會(huì)對(duì)土壤微生物種群產(chǎn)生一定影響。

5 結(jié)論

①利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三亞臨春嶺森林公園三個(gè)區(qū)域土壤的細(xì)菌多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，三個(gè)區(qū)域共獲得1936個(gè)OTU，分屬于20個(gè)門，此外還有部分未分類細(xì)菌。景區(qū)土壤細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為：人工成熟林區(qū)>景觀綠化區(qū)>游人干擾區(qū)。

②變形菌門(Proteobacteria)是土壤細(xì)菌群落中相對(duì)豐度最高的門類，在土壤細(xì)菌類群中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌門類相對(duì)單一或許與櫞隆桉的化感作用相關(guān)。