岳瑩雪,王玉琦,閆芬芬,李 娜,李柏良,霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

丁酸又稱酪酸,是一種短鏈脂肪酸,無色至淺黃色透明油狀液體,具有濃烈干酪般不愉快氣味,廣泛應(yīng)用于工業(yè)化學(xué)品、動(dòng)物飼料添加劑、食品和藥品等領(lǐng)域,每年全球市場量超過8×104噸[1]。丁酸作為一種重要的精細(xì)化工原料,主要用于制造丁酸纖維素和合成丁酸酯。合成丁酸的化學(xué)方法主要有3種:正丁醛氧化法、正丁醇氧化法及丙烯羰基化法。此外,許多從廢水、土壤、受污染的乳制品和食品、肉類和動(dòng)物消化系統(tǒng)中分離的菌株適合生產(chǎn)生物丁酸,目前共報(bào)道了超過10種產(chǎn)丁酸的菌株(如梭菌屬、丁弧菌屬、丁桿菌屬、真細(xì)菌屬、大梭桿菌屬和八疊球菌屬)[2]。雖然生物合成方法生產(chǎn)丁酸的生產(chǎn)率低,丁酸回收成本高[3],但消費(fèi)者更喜歡天然來源的丁酸,尤其是在食品添加劑和藥品領(lǐng)域。隨著食品工業(yè)副產(chǎn)品供應(yīng)量的增加,消費(fèi)者對(duì)丁酸生產(chǎn)的有機(jī)天然產(chǎn)品的需求增加,通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的丁酸在食品添加劑、藥品和防腐劑等方面發(fā)展趨勢較好。在食品領(lǐng)域中丁酸還可被用作乳酸工業(yè)中的酸或作為食物酯形式的添加劑來增加水果香味[4]。在其他方面丁酸被視為未來再生的綠色化學(xué)品之一,可以替代化石燃料使用,并減少與健康和環(huán)境有關(guān)的問題,包括溫室氣體排放,全球變暖和氣候變化。同時(shí),丁酸還具有促進(jìn)健康的作用,如為腸上皮細(xì)胞提供能量并且保護(hù)腸黏膜屏障中的機(jī)械和化學(xué)屏障[5]。人和動(dòng)物胃腸道中都有大量產(chǎn)丁酸的微生物,這些微生物及其發(fā)酵產(chǎn)物丁酸對(duì)宿主有著重要的意義,具有維護(hù)腸道健康、增強(qiáng)機(jī)體免疫、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗氧化等多重生理功能。因此,深入研究丁酸生產(chǎn)的方法及其調(diào)節(jié)腸道的生理功能具有重要的意義。本文主要綜述了生產(chǎn)丁酸的方法以及其在腸道中的生理功能,為進(jìn)一步研究丁酸生理功能的作用機(jī)制提供理論參考。

1 丁酸的生產(chǎn)方法

1.1 丁酸的化學(xué)合成

1.1.1 正丁醛氧化法 正丁醛氧化法是以正丁醛為原料,以空氣或氧氣為氧化劑,在有無催化劑的情況下均可完成的一種反應(yīng)。韓奎武等[6]通過分子氧液相氧化利用正丁醛生產(chǎn)正丁酸,在不使用催化劑、最佳反應(yīng)溫度為55～60 ℃、反應(yīng)時(shí)間6～7 h、氧氣流量10.8～11.8 L/h和反應(yīng)液中過氧化物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%的條件下,得到反應(yīng)液中正丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82%～86%。反應(yīng)原理為:CH3CH2CH2CHO+O2→CH3CH2CH2COOOH;CH3CH2CH2CHO+CH3CH2CH2COOOH→2CH3CH2CH2COOH。李興存等[7]研究了塔式反應(yīng)器的氧化反應(yīng)過程,在氧醛摩爾比0.75～0.875、反應(yīng)溫度50～60 ℃、催化劑與正丁醛的質(zhì)量比0.1%～0.2%條件下反應(yīng)3 h左右,正丁醛的轉(zhuǎn)化率在99.5%以上,而正丁酸的選擇性超過了95.0%。其反應(yīng)原理主反應(yīng)為CH3(CH2)2CHO+1/2O2→CH3(CH2)2COOH,副反應(yīng)為CH3(CH2)2CHO+2O2→CH3CH2COOH+CO2+H2O;CH3(CH2)2CHO+O2→CH3CH2CH2OH+CO2;CH3(CH2)2COOH+CH3(CH2)2OH CH3(CH2)2CO2(CH2)2CH3+H2O。試驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 正丁醛氧化制備正丁酸試驗(yàn)流程圖

1.1.2 正丁醇氧化法 楊長安等[8]采用新工藝將TS分子篩作為催化劑,H2O2作為氧化劑,催化氧化正丁醇生產(chǎn)正丁酸,得到最佳生產(chǎn)工藝條件為:W(TS)/n(正丁醇)為6.1 g/mol,n(正丁醇):n(H2O2,30%)為1∶3,反應(yīng)溫度為90 ℃、反應(yīng)時(shí)間為12 h,此時(shí)正丁醇的轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%,選擇性在99.5%以上。

1.1.3 丙烯羰基化法 丙烯羰基化法以丙烯與合成氣為原料,其工藝分為兩步進(jìn)行:首先丙烯羰基化生成丁醛,而后在丁醛生成塔中通入氧氣使丁醛氧化產(chǎn)生丁酸,但該法在生產(chǎn)丁酸的過程中會(huì)產(chǎn)生一種副產(chǎn)物異丁酸。若以SnCl2、CoCl2和FeCl3的Pd(PPh3)Cl2為催化劑,則可提高生產(chǎn)正丁酸的選擇性以抑制副產(chǎn)物的生成[9]。

其中,正丁醛氧化法具有原料單一、工藝路線簡單、生產(chǎn)控制方便、產(chǎn)品收率較高等優(yōu)點(diǎn)。正丁醇氧化法具有高效、清潔、成本低的特點(diǎn),并且催化劑易于回收重復(fù)利用,具有廣闊的應(yīng)用和市場前景。因此采用此兩種方法優(yōu)勢較大,其中正丁醛氧化法應(yīng)用較早。相比前兩種方法,丙烯羰基合成法由于生產(chǎn)投資較大,在生產(chǎn)過程中存在中間產(chǎn)物正丁醛,隨著工業(yè)中普遍應(yīng)用正丁醛氧化制正丁酸,丙烯羰基合成法已逐步被淘汰。

1.2 丁酸的生物合成

1.2.1 梭菌合成丁酸 在幾種厭氧梭菌(丙酮丁醇梭菌、酪酸梭菌、拜氏梭菌)發(fā)酵過程中,丁酸為主要終產(chǎn)物[10]。其中酪酸梭菌具有營養(yǎng)需求簡單、丁酸產(chǎn)率高以及對(duì)毒性代謝物有更好耐受性等特點(diǎn),因此被證明是丁酸工業(yè)生產(chǎn)中最具前途的梭菌之一[11]。用葡萄糖和木糖作為碳源,兩碳源均經(jīng)反應(yīng)生成丙酮酸,最終生成主要產(chǎn)物丁酸,其中會(huì)伴隨少量乳酸、乙酸、丁醇的產(chǎn)生,在梭菌中合成丁酸的具體代謝途徑如圖2所示。有研究報(bào)道[12],酪丁酸梭菌通過刪除乙酸激酶基因,構(gòu)建了一個(gè)名為PAK-Em的突變體,在纖維床生物反應(yīng)器中的固定化細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)的細(xì)胞固定化發(fā)酵下,最終的丁酸濃度和丁酸產(chǎn)量分別達(dá)到50.1和0.45 g/g的較高水平。

圖2 以葡萄糖和木糖為碳源的梭菌中丁酸合成的代謝途徑。

微生物法生產(chǎn)丁酸的反應(yīng)途徑還可利用基因組分析進(jìn)行進(jìn)一步研究,目前,已知酪丁酸梭菌ATCC 25755的完整基因組序列[13],使研究人員能夠全面了解丁酸生產(chǎn)過程中的微生物生理反應(yīng)。對(duì)酪丁酸梭菌的全基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析,將促進(jìn)以代謝工程法生產(chǎn)丁酸的發(fā)展[14]。Chi等[15]研究發(fā)現(xiàn),以梭菌ATCC 27405和梭菌ATCC 49875共培養(yǎng)分批發(fā)酵稻草,丁酸產(chǎn)量高達(dá)33.9 g/L。Song等[16]用褐藻和裙帶菜生產(chǎn)丁酸,在適當(dāng)?shù)臈l件下酪丁酸梭菌的丁酸濃度達(dá)到11 g/L。Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn),一種含有半乳糖作為主要碳水化合物的紅藻也被用于生產(chǎn)丁酸,當(dāng)使用經(jīng)酸預(yù)處理的紅藻水解產(chǎn)物時(shí),梭菌 S1的丁酸產(chǎn)量為4.83 g/L。因此,梭菌是生產(chǎn)丁酸重要的微生物。

1.2.2 其它生物方法合成丁酸 目前,葡萄糖、糖蜜、玉米和小麥等已被廣泛用于丁酸的生產(chǎn)[18]。然而,糖基原料是食品供應(yīng)或動(dòng)物飼料中的主要成分,用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品,對(duì)于丁酸的大規(guī)模生產(chǎn)是不可持續(xù)的。因此,需要大量與食物無關(guān)的替代原料。目前已經(jīng)有各種材料,包括食品工業(yè)、生物柴油工業(yè)的副產(chǎn)品(乳清、甘油等)和天然未利用生物質(zhì)(淀粉、木質(zhì)纖維素生物質(zhì)、藻類生物質(zhì)等)被視為生產(chǎn)丁酸的替代原料。乳清因含有糖、蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì),是一種適合生產(chǎn)丁酸的原料。當(dāng)以乳清為底物添加5 g/L酵母提取物時(shí),丁酸發(fā)酵的性能明顯增強(qiáng),與沒有添加酵母提取物的發(fā)酵相比,最終丁酸的濃度提高了1.88倍[19]。在以粗甘油為碳源、非無菌的條件下,Varrone等[20]研究了發(fā)酵混合微生物培養(yǎng)產(chǎn)丁酸的性能,最終丁酸的生產(chǎn)水平高達(dá)0.46 g(L·h),與初始的結(jié)果相比較提高了2.7倍。Reid等[21]直接利用淀粉生物質(zhì),如馬鈴薯淀粉和支鏈淀粉發(fā)酵合成丁酸。當(dāng)使用木糖(14 g/L)、纖維素(14 g/L)和半乳糖(14 g/L)為碳源時(shí),利用一種噬熱放線菌muS-1產(chǎn)生了較高水平的丁酸(70.4 g/L)[22]。以玉米粉與蒸餾水配制經(jīng)糊化和糖化處理的發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵溶劑型丙酮丁醇梭菌,在產(chǎn)酸過程中可產(chǎn)生丁酸和乙酸,而主要的發(fā)酵產(chǎn)物為丙酮、丁醇和乙醇[23]。同時(shí),也有研究表明,乳酸菌在含魚類的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵,利用高效液相色譜法可檢測到丁酸的產(chǎn)生[24]。

化學(xué)合成法為生產(chǎn)丁酸常用的方法,丙烯羰基合成法生產(chǎn)丁酸成本較高并且有副反應(yīng)產(chǎn)生,產(chǎn)率降低,純度不高。而正丁醛氧化法與新型工藝正丁醇氧化法則高效成本低,值得開發(fā)研究。同時(shí),生物合成法生產(chǎn)的丁酸更加天然,應(yīng)用于食品中更加健康安全。

2 丁酸的腸道生理功能

2.1 丁酸對(duì)腸道微生態(tài)及腸道黏膜的影響

2.1.1 丁酸對(duì)腸道微生態(tài)的影響 腸道內(nèi)的丁酸菌可合成腸道丁酸,在生物合成反應(yīng)中利用的主要生物酶為丁酰輔酶A和乙酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶。生物酶以乳酸為底物,避免了腸道內(nèi)乳酸菌生物代謝積累過量的乳酸對(duì)腸黏膜造成破壞,從而維持腸道內(nèi)微生態(tài)的平衡。酪酸梭菌產(chǎn)生丁酸,具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群平衡并重新建立平衡腸道微生態(tài)環(huán)境的功能。王愛華[25]在斷奶仔豬、仔雞的飼糧中加入丁酸鈉后,發(fā)現(xiàn)其腸道細(xì)菌中乳酸桿菌的比例增大,大腸桿菌的比例減小,沙門氏菌對(duì)盲腸的感染率減少,即腸道菌群平衡有所改善。腸道微生態(tài)失調(diào)是腹瀉的主要原因之一,丁酸可促進(jìn)有益微生物增殖并且抑制有害微生物繁殖,從而改善腸道微生態(tài)平衡,在丁酸被利用的同時(shí),也促進(jìn)了鈉、鉀和水等對(duì)止瀉有利物的吸收[26]。

2.1.2 丁酸對(duì)腸道黏膜的影響 丁酸一方面影響覆蓋于結(jié)腸上皮黏液中的粘蛋白和TFFs(三葉因子)來提高腸黏膜的屏障能力,另一方面影響結(jié)腸上皮的通透性,增加腸道的屏障能力,減少炎癥因子的產(chǎn)生,延緩潰瘍性結(jié)腸炎或其它炎癥。有試驗(yàn)表明[27],丁酸鹽能夠刺激人類結(jié)腸細(xì)胞系(LS174T)產(chǎn)生粘蛋白MUC2,而MUC2基因表達(dá)的增加促進(jìn)了黏蛋白MUC2合成,加強(qiáng)了對(duì)黏膜層的保護(hù)。SCFA(短鏈脂肪酸)滴注法[28]表明,丁酸具有修復(fù)腸道黏膜的作用。大鼠模型進(jìn)一步證實(shí),丁酸的確能減輕實(shí)驗(yàn)性腸炎對(duì)黏膜的損傷[29]。Vieira等[30]給DSS(葡聚糖硫酸鈉)誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎的小鼠口服丁酸以后,發(fā)現(xiàn)丁酸可到達(dá)結(jié)腸,并抑制免疫細(xì)胞激活以緩解黏膜病變,從而緩解炎癥損傷。Abdelqader等[31]研究了丁酸對(duì)熱應(yīng)激肉雞性能、腸道組織學(xué)變化、有益腸道細(xì)菌計(jì)數(shù)和恢復(fù)反應(yīng)的影響,發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激引起的腸道損傷與腸道相對(duì)重量的顯著減少有直接關(guān)系,這可能表明,丁酸通過直接刺激增殖或抑制腸上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡,對(duì)黏膜恢復(fù)發(fā)揮積極作用。

2.2 丁酸對(duì)腸炎的影響

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種嚴(yán)重影響人類健康的炎癥性腸道疾病,丁酸首先可激活GPRs(G蛋白偶聯(lián)受體),受體主要包括GPR43、GPR41和GPR109A,還可激活過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors gamma,PPARγ),從而激活其下游的信號(hào)通路,對(duì)炎癥因子表達(dá)、免疫細(xì)胞的分化和遷移產(chǎn)生影響。丁酸與GPR結(jié)合后,激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路,影響炎癥因子表達(dá)。其次,丁酸也可激活過氧化物酶體增殖物激活受體,促進(jìn)緊密連接蛋白表達(dá),保證腸道的屏障能力。最后,丁酸作為組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor,HDACI),還可以抑制NF-κB(核因子-κB)信號(hào)通路的激活、抑制炎癥因子的表達(dá)、促進(jìn)T細(xì)胞凋亡和腸道抗菌肽的分泌[32],丁酸抑制潰瘍性結(jié)腸炎分子機(jī)制如圖3所示。Cox等[33]發(fā)現(xiàn),丁酸可通過Gpr43配體抑制由LPS(脂多糖)刺激的人單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1(白細(xì)胞介素-1)、腫瘤壞死因子、干擾素γ,且隨著丁酸濃度越大,對(duì)炎癥因子的抑制作用越強(qiáng)。敲除小鼠的GPR109A基因?qū)е卵装Y反應(yīng)加重,而丁酸的添加會(huì)使IL-6(白細(xì)胞介素-6)的表達(dá)量下降,IL-18(白細(xì)胞介素-18)的表達(dá)提高,同時(shí)促進(jìn)了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖。Singh等[34]研究發(fā)現(xiàn),GPR109A(由Niacr1編碼)是丁酸在結(jié)腸的受體,能夠促進(jìn)結(jié)腸巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞發(fā)揮抗炎癥作用,并且能夠使它們誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和產(chǎn)生IL-10(白細(xì)胞介素-10)的T細(xì)胞。另外,GPR109A在丁酸誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-18的過程中起著重要作用。上述研究證明,丁酸可以激活GPR影響炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-18等的表達(dá),從而緩解腸道炎癥。由于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是有效的抗炎細(xì)胞,其產(chǎn)生與增殖一定程度對(duì)炎癥產(chǎn)生影響。

圖3 丁酸抑制潰瘍性結(jié)腸炎分子機(jī)制示意圖

2.3 丁酸對(duì)腸癌的影響

結(jié)直腸癌是指發(fā)生在人和動(dòng)物大腸部位的惡性腫瘤,是一種最常見的惡性腫瘤。結(jié)直腸癌在癌癥發(fā)病率中排名第三,在全球癌癥死亡率中排名第四[35]。丁酸對(duì)結(jié)腸癌癥細(xì)胞的主要作用是通過抑制細(xì)胞增殖,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的停滯。丁酸能夠誘導(dǎo)正常細(xì)胞隱窩基底細(xì)胞的增殖,提高健康組織的轉(zhuǎn)化和維護(hù)效率,抑制癌細(xì)胞隱窩表面(潛在的腫瘤發(fā)育位點(diǎn))細(xì)胞的增殖[36]。Ogawa等[37]研究表明,丁酸菌的代謝產(chǎn)物丁酸能發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增生的作用,也能抑制因表皮生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增生,同時(shí)下調(diào)環(huán)氧合酶,進(jìn)而抑制人腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成,抑制癌細(xì)胞的生長。對(duì)人類結(jié)腸中丁酸鹽和G蛋白偶聯(lián)受體GPR109A之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),丁酸鹽與GPR109A的結(jié)合可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡[38]。Daroqui等[39]的研究顯示,丁酸鹽可通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)、修飾組蛋白,抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞中原癌基因c-myc、細(xì)胞周期蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。目前,丁酸抗腫瘤的理論已成功用于大腸癌的預(yù)防和潰瘍性結(jié)腸炎的治療中。

2.4 丁酸對(duì)腸道免疫調(diào)節(jié)的影響

在某種程度上,炎癥性腸病是由免疫混亂引起的,而丁酸類代謝產(chǎn)物直接影響宿主的免疫應(yīng)答,在調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎免疫混亂中起到重要作用。NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中處于中心地位,丁酸抑制NF-κB信號(hào)途徑和促進(jìn)T細(xì)胞凋亡是其能夠治療UC(潰瘍性結(jié)腸炎)的重要特性。丁酸可以抑制趨化因子的表達(dá)、抑制白細(xì)胞遷移,從而緩解炎癥反應(yīng),體外試驗(yàn)表明,丁酸可以通過GPR43受體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移[40]。Kvale等[41]通過對(duì)體外結(jié)腸上皮細(xì)胞株HT-29的作用研究,認(rèn)為丁酸促進(jìn)白細(xì)胞抗原-1(HLA-1)的表達(dá),與IL-4(白細(xì)胞介素-4)、TNF(腫瘤壞死因子)、ICAM-1(細(xì)胞黏附因子-1)的分泌有關(guān),而這些因子則可直接參與結(jié)腸細(xì)胞的免疫應(yīng)答。丁酸鹽可以通過誘導(dǎo)脾臟組織中PD-1/PD-L1信號(hào)通路的方式促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖,并在結(jié)腸組織中通過抑制巨噬細(xì)胞表面趨化因子受體和配體表達(dá)量的方式,對(duì)結(jié)腸組織中M1/M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)[42],而M1/M2型巨噬從初始狀態(tài)分化成具有特定免疫模式的狀態(tài),進(jìn)而分別介導(dǎo)了腸道內(nèi)各個(gè)類型免疫與炎癥反應(yīng)的平衡[43]。

丁酸作為一種短鏈脂肪酸對(duì)改善腸道微生態(tài)平衡、修復(fù)腸黏膜具有一定影響,對(duì)腸道疾病如腸炎、腸癌具有緩解作用,而對(duì)疾病的影響與丁酸對(duì)腸道的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。

3 結(jié)論與展望

由于在食品和藥物中生物基綠色添加劑的需求日益增加,丁酸的微生物發(fā)酵法現(xiàn)已成為替代化學(xué)合成的方法。但工業(yè)發(fā)酵丁酸生產(chǎn)需要廉價(jià)的原料、高效的工藝性能、高純度的產(chǎn)品和生產(chǎn)菌株的穩(wěn)健性。所以通過基因工程方法以及優(yōu)化發(fā)酵條件使丁酸發(fā)酵菌株產(chǎn)生高的丁酸產(chǎn)率有待研究。丁酸雖然對(duì)腸道微生態(tài)及腸道疾病有一定作用,但目前研究多借助單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞研究,結(jié)合具體的動(dòng)物模型或臨床實(shí)驗(yàn)的報(bào)道很少,對(duì)丁酸作用腸道疾病作用機(jī)制的研究單一,還需大量實(shí)驗(yàn)全面考慮其對(duì)腸道疾病的作用機(jī)理。隨著丁酸研究的進(jìn)一步深入以及丁酸生理功能作用機(jī)制的進(jìn)一步闡釋,丁酸必將在保健、腫瘤預(yù)防與治療等領(lǐng)域發(fā)揮更廣泛的作用。