郭愛(ài)民,李亞俊,曹 卉,周海濤,曹建民,胡 戈,牛衍龍,任 奕

(1.中國(guó)石油大學(xué)(北京),北京 102249;2.中南大學(xué),湖南長(zhǎng)沙 410083;3.北京體育大學(xué),北京 100084;4.北京聯(lián)合大學(xué),北京 100023;5.北京聯(lián)合大學(xué),生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100191;6.贛南醫(yī)學(xué)院,江西贛州 341000)

科學(xué)、合理的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以有效促進(jìn)心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)性和生理性重塑,改善心臟功能,提高生活質(zhì)量和健康水平[1]。競(jìng)技體育中常以長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度訓(xùn)練刺激機(jī)體以提高運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力和競(jìng)技水平,受運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、訓(xùn)練周期、恢復(fù)時(shí)間等多重因素影響,運(yùn)動(dòng)員常出現(xiàn)過(guò)度訓(xùn)練綜合癥并誘發(fā)多器官出現(xiàn)病理改變和功能紊亂[2]。長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí),各器官血流量發(fā)生急劇變化,尤其是心臟,需氧量顯著增加,氧自由基的產(chǎn)生隨之增加,抗氧化能力減弱[3-4]。在低濃度時(shí),氧自由基在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)過(guò)程中起著“氧化還原信使”的作用[5],但過(guò)量氧自由基會(huì)加劇氧化應(yīng)激反應(yīng),引起蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過(guò)氧化以及DNA損傷,誘發(fā)凋亡信號(hào),導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的損傷和死亡[6],與心臟功能紊亂、心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。由此可見(jiàn),長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)引發(fā)的氧化應(yīng)激增強(qiáng),是誘發(fā)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷的主要原因。

細(xì)胞凋亡在過(guò)度訓(xùn)練引發(fā)的運(yùn)動(dòng)性心肌損傷中發(fā)揮了重要的作用[8]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,受kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)調(diào)控。Nrf2通過(guò)識(shí)別靶基因啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件ARE(antioxidant response element,ARE),調(diào)節(jié)下游眾多抗氧化酶的基因表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,從而抵抗氧化應(yīng)激。Nrf2也可與B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(B cell lymphoma-2 protein,Bcl-2)抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合,通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá),下調(diào)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)表達(dá),阻止細(xì)胞凋亡[9]。姜黃素是從姜科、天南星科中的部分植物根莖中提取的一種天然色素,作為世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)的天然食品添加劑及我國(guó)最早批準(zhǔn)使用的天然色素之一,被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[10]。姜黃素作為一種多酚類(lèi)化合物,具有抗氧化、抑炎及抑制腫瘤生長(zhǎng)等藥理作用,其在醫(yī)學(xué)界的應(yīng)用已得到越來(lái)越多的重視,在抗癌、抗炎、預(yù)防老年癡呆等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。姜黃素可以直接使Nrf2上絲/蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化,促進(jìn)Nrf2核易位[11],促進(jìn)Nrf2與ARE的結(jié)合,誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表達(dá)增加[12],抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。Keap1蛋白上的三個(gè)反應(yīng)性半胱氨酸殘基Cys-151、Cys-273和Cys-288,能夠與親電子化合物共價(jià)結(jié)合[13],姜黃素中的酚羰基可以與半胱氨酸殘基上的巰基發(fā)生加成反應(yīng),促使Nrf2-Keap1解偶聯(lián),從而促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)位[14]。姜黃素作為一種抗氧化劑,具有酚羥基和β-二酮2個(gè)活性部位,均可以提供質(zhì)子,直接參與阻斷自由基的反應(yīng)[15]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明姜黃素對(duì)過(guò)度訓(xùn)練引發(fā)的大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和功能損傷均具有保護(hù)作用,其機(jī)制與減輕凋亡、抑制炎癥有關(guān)[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究,通過(guò)觀察心肌組織病理學(xué)的改變,檢測(cè)心肌損傷標(biāo)志物,結(jié)合心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)以及細(xì)胞凋亡水平變化,來(lái)探討姜黃素是否可以通過(guò)延緩過(guò)度訓(xùn)練所致氧化應(yīng)激,有效抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素 純度>99%,陜西源泰生物科技公司;羧甲基纖維素鈉 純度>99%,上海士鋒生物科技有限公司;睪酮(testosterone,T)、皮質(zhì)酮(corticosterone,Cor)放射免疫試劑盒 武漢Servicebio試劑公司;心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、心肌總抗氧化能力(Total antioxidative capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)酶聯(lián)免疫試劑盒 美國(guó)BD公司;TUNEL心肌細(xì)胞凋亡測(cè)試試劑盒 瑞士Roche公司;Nrf2、HO-1、Bax和Bcl-2的一抗、二抗和DAB顯色劑 武漢Servicebio試劑公司;SPF級(jí)雄性Wistar大鼠63只 體重(218.4±10.7) g 49 d齡,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部(動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào)SCXK(京)2016-0010);基礎(chǔ)飼料 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。

Allegra 25R型臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司;Wellscan MK3型酶標(biāo)儀 美國(guó)雷博公司;Pannoramic MIDI全自動(dòng)數(shù)字切片掃描系統(tǒng) 匈牙利3D HISTECH公司;r-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀 中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司;722型分光光度計(jì) 上海分析儀器三廠;NR-B17CC型超低溫冰箱 日本松下;ISO9001型電子天秤 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DY89-Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;DK-2000-Ⅲ L型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;LEICA RM2016型病理切片機(jī) 德國(guó)RM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)室溫度(22±2) ℃,相對(duì)濕度55%～75%,光照時(shí)間隨正常晝夜節(jié)律。大鼠以基礎(chǔ)飼料和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食。

63只大鼠首先進(jìn)行4 d適應(yīng)性飼養(yǎng),然后以20 min/d的運(yùn)動(dòng)量進(jìn)行為期3 d的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,剔除不符合實(shí)驗(yàn)要求的3只大鼠后,剩余60只大鼠以數(shù)字隨機(jī)分組法分為3組(直接標(biāo)號(hào)法編號(hào)):安靜對(duì)照組(C組,12只)、過(guò)度訓(xùn)練組(OM組,24只)和姜黃素+過(guò)度訓(xùn)練組(COM組,24只)。訓(xùn)練結(jié)束后,受訓(xùn)練強(qiáng)度、頻度、負(fù)重情況、恢復(fù)時(shí)間等因素影響,OM、COM組大鼠出現(xiàn)死亡,分別剩余11只和14只。

1.2.2 營(yíng)養(yǎng)干預(yù)與訓(xùn)練方案 C組常規(guī)飼養(yǎng),不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)。OM、COM組采用8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練,具體方案[18-19]詳見(jiàn)圖1。姜黃素用0.5%的羧甲基纖維素納配成混懸液,4 ℃存放備用。訓(xùn)練過(guò)程中,對(duì)COM組大鼠進(jìn)行姜黃素營(yíng)養(yǎng)干預(yù),根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定姜黃素干預(yù)組劑量為200 mg/(kg·d)[20],灌胃體積為5 mL/kg,其余兩組灌胃等體積0.5%的羧甲基纖維素納,采用專(zhuān)業(yè)灌胃器每天灌胃一次。

圖1 大鼠游泳訓(xùn)練方案

1.2.3 樣本采集 末次訓(xùn)練結(jié)束24 h后,各組大鼠乙醚麻醉,頸總動(dòng)脈取血,37 ℃自然凝固,待血清出現(xiàn)后,放入冰箱24 h后,4 ℃、3000 r/min離心10 min,得到上清液即為血清,置-20 ℃冰箱中保存待查。迅速取部分左心室心肌組織浸入4%多聚甲醛固定液中。同時(shí),另取部分左心室心肌組織,置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污,準(zhǔn)確稱(chēng)量重量后按照1∶9的比例加入PBS緩沖液,以玻璃勻漿器在冰上充分研磨后進(jìn)行超聲破碎。超聲在冰浴中進(jìn)行,功率200 W,單次不超過(guò)3 s,根據(jù)破碎程度重復(fù)2～3次。破碎后經(jīng)5000 r/min離心5 min取上層清液待測(cè)。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)試

1.2.4.1 心肌組織形態(tài)評(píng)價(jià) 將心肌組織從固定液中取出,流水洗滌12 h,將組織依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脫水透明,石蠟包埋,制成4 μm切片,HE染色。在400倍光學(xué)顯微鏡下,進(jìn)行心肌組織形態(tài)評(píng)價(jià)[21]。

1.2.4.2 血清T、Cor[21]和cTnI[22]的檢測(cè) 將分裝后的各組大鼠的血清按照試劑盒的相關(guān)步驟,采用放射免疫法進(jìn)行血清T和Cor測(cè)定,并計(jì)算T/Cor比值;采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行血清cTnI測(cè)定。

1.2.4.3 心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2表達(dá)[21-22]采用免疫組化法檢測(cè)心肌Nrf-2、HO-1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)。石蠟切片脫蠟至水經(jīng)抗原修復(fù)后,加入3%雙氧水溶液室溫避光孵育25 min后脫色洗滌3次進(jìn)行血清封閉,隨后加入上述相應(yīng)蛋白的一抗、二抗,進(jìn)行DAB顯色,Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后脫水封片。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞核著色程度和范圍進(jìn)行H-score評(píng)分評(píng)定[23],其中深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性,棕黃色為中度陽(yáng)性,淺黃色為弱陽(yáng)性,藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。H-score=(弱陽(yáng)性細(xì)胞密度×1)+(中陽(yáng)性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞密度×3)。

1.2.4.4 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)[22]采用Tunel法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(H-score)。石蠟切片脫蠟至水,經(jīng)修復(fù)、破膜后,將末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶、脫氧尿苷三磷酸按2∶29比例混合,覆蓋組織。切片平放于濕盒內(nèi),37 ℃孵育2 h后加入3%過(guò)氧化氫溶液,室溫避光孵育15 min。在converter-POD液中,37 ℃孵育30 min。洗滌,DAB顯色,Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核后,流水沖洗,將切片依次放入75%酒精5 min、85%酒精5 min、無(wú)水乙醇Ⅰ 5 min、無(wú)水乙醇Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅰ 5 min 中脫水,之后將切片拿出晾干,封片。采用Pannoramic MIDI病理切片掃描儀將每張切片內(nèi)陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量及其染色強(qiáng)度轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的數(shù)值,應(yīng)用公式計(jì)算H-score從而對(duì)其進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野,每個(gè)視野100個(gè)細(xì)胞,其中細(xì)胞核呈深棕色為強(qiáng)陽(yáng)性,棕黃色為中度陽(yáng)性,淺黃色為弱陽(yáng)性,藍(lán)色細(xì)胞核為陰性。進(jìn)而對(duì)每個(gè)組織點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別分析出強(qiáng)陽(yáng)性、中度陽(yáng)性、弱陽(yáng)性及陰性的面積(單位:像素)和陽(yáng)性百分比,最后進(jìn)行H-score評(píng)分評(píng)定,H-score=(弱陽(yáng)性細(xì)胞密度×1)+(中陽(yáng)性細(xì)胞密度×2)+(強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞密度×3)。

1.2.4.5 心肌T-AOC、SOD活性和MDA濃度的檢測(cè) 將分裝后的各組大鼠的血清按照試劑盒的相關(guān)步驟,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)T-AOC、SOD活性以及MDA濃度[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊時(shí)采用LSD法,方差不齊采用Tamhane法。p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組大鼠心肌組織形態(tài)

圖2顯示,C組心肌纖維著色均勻,肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,呈短柱狀,細(xì)胞境界清晰,細(xì)胞質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色,且分布均勻。OM組心肌纖維著色明顯不均勻,結(jié)構(gòu)不清晰,細(xì)胞境界模糊不清,心肌纖維出現(xiàn)腫脹,且有彎曲或斷裂現(xiàn)象。COM組心肌纖維著色呈均勻紅色,結(jié)構(gòu)與細(xì)胞境界清晰,僅見(jiàn)心肌纖維出現(xiàn)輕度腫脹和彎曲。

圖2 各組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)變化(HE,400×)

2.2 各組大鼠血清睪酮、皮質(zhì)酮、肌鈣蛋白Ⅰ水平變化

T/Cor比值被認(rèn)為是監(jiān)控運(yùn)動(dòng)者機(jī)能狀況的敏感指標(biāo),可以有效反映機(jī)體合成和分解代謝的平衡情況[24]。以往的研究將T/Cor比值下降30%定為人體過(guò)度訓(xùn)練的診斷標(biāo)準(zhǔn)[25]。本研究結(jié)果顯示(表1),OM組血清T極顯著低于C組(p<0.01),血清Cor極顯著高于C組(p<0.01);COM組血清T極顯著高于OM組(p<0.01),血清Cor顯著低于OM組(p<0.01)。組間T/Cor比值變化與T變化相一致,其中OM組大鼠T/Cor比值較C組下降達(dá)86.33%,證明本研究成功建立過(guò)度訓(xùn)練動(dòng)物模型。

表1 各組大鼠血清睪酮、皮質(zhì)酮、肌鈣蛋白水平Table 1 Serum testosterone,corticosterone and cardiac troponin I levels between rats in each

cTnI是構(gòu)成心肌肌鈣蛋白的三個(gè)亞基之一,僅在心肌中表達(dá)。正常情況下游離型cTnI僅在心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)少量存在,大部分cTnI則以復(fù)合體形式存在[26]。研究表明[26-27],長(zhǎng)時(shí)程高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可造成心肌出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷,游離型cTnI迅速?gòu)氖軗p細(xì)胞濾出造成其在血液中含量升高;同時(shí),隨著心肌細(xì)胞凋亡增強(qiáng),cTnI從復(fù)合體中分解,大量cTnI被釋放到血液循環(huán)中,高濃度的cTnI不僅可在運(yùn)動(dòng)后即刻出現(xiàn),甚至可維持到運(yùn)動(dòng)后24h。由于cTnI具有高度的特異性和敏感性,其作為反映運(yùn)動(dòng)負(fù)荷是否造成心肌損傷的生物學(xué)標(biāo)志物已被廣泛認(rèn)可[28]。本研究結(jié)果顯示(表1),OM組血清cTnI極顯著高于C組(p<0.01),COM組顯著低于OM組(p<0.05),結(jié)合心肌組織形態(tài)出現(xiàn)一系列病理學(xué)改變,說(shuō)明8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練致大鼠過(guò)度訓(xùn)練并引發(fā)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷,而在訓(xùn)練過(guò)程中補(bǔ)充姜黃素可以有效緩解心肌損傷的發(fā)生與發(fā)展。

2.3 各組大鼠心肌Nrf-2和HO-1表達(dá)變化

Nrf2被稱(chēng)為抗氧化反應(yīng)的“主要調(diào)節(jié)劑”,是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)也是維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)者,通過(guò)與ARE相互作用,調(diào)節(jié)下游多種抗氧化基因的表達(dá)[29]。HO-1作為Nrf2下游靶標(biāo),廣泛參與Nrf2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)答過(guò)程[30]。本研究結(jié)果顯示(表2,圖3),OM組心肌Nrf2表達(dá)與C組無(wú)顯著差異(p>0.05),HO-1表達(dá)顯著低于C組(p<0.05);COM組心肌Nrf2表達(dá)極顯著高于OM組(p<0.01),HO-1表達(dá)顯著高于OM組(p<0.05)。這一變化可能是由于長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)抑制了Nrf2和Keap1二聚體的解離過(guò)程,阻礙Nrf2進(jìn)行核易位,導(dǎo)致HO-1表達(dá)減少。

圖3 各組大鼠心肌Nrf2和HO-1表達(dá)情況(TUNEL,400×)

表2 各組大鼠心肌Nrf2和HO-1的H-score結(jié)果Table 2 H-score of Nrf2 and HO-1 in myocardium between rats in each

而姜黃素作為Nrf2的激動(dòng)劑,可以通過(guò)誘導(dǎo)Nrf2核易位,增強(qiáng)下游抗氧化基因表達(dá),緩解心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)。本研究結(jié)果表明,補(bǔ)充姜黃素的COM組大鼠心肌組織Nrf2(p<0.01)和HO-1(p<0.05)表達(dá)水平極顯著/顯著高于OM組,這與多項(xiàng)研究結(jié)果是一致的。He等[31]的研究發(fā)現(xiàn),姜黃素通過(guò)激活Nrf2及HO-1,有效改善高脂肪飲食誘導(dǎo)的小鼠肌肉氧化應(yīng)激狀態(tài)。Zhao等[32]的研究中,姜黃素的預(yù)處理減弱了氧自由基生成,并顯著拮抗LO2肝細(xì)胞中葡萄糖氧化酶誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化。石瑤等[33]的研究表明,姜黃素通過(guò)上調(diào)HO-1活性,抑制氧化應(yīng)激引發(fā)的心肌細(xì)胞損傷。這表明姜黃素可以通過(guò)激活Nrf2通路,上調(diào)Nrf2和HO-1表達(dá)水平,通過(guò)抑制氧化應(yīng)激減輕細(xì)胞損傷。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平及Bax和Bcl-2表達(dá)變化

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,包括以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白。這些蛋白之間動(dòng)態(tài)平衡的輕微變化參與過(guò)度訓(xùn)練誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展。Bcl-2/Bax比值的變化,決定細(xì)胞凋亡發(fā)生的走向[35]。本研究結(jié)果顯示(表3、圖4、圖5),與C組相比,OM組心肌細(xì)胞凋亡水平極顯著升高(p<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著減弱(p<0.05),促凋亡蛋白Bax表達(dá)極顯著增強(qiáng)(p<0.01),Bcl-2/Bax比值極顯著降低(p<0.01)。上述結(jié)果說(shuō)明,長(zhǎng)時(shí)程、大強(qiáng)度致過(guò)度訓(xùn)練引發(fā)氧化應(yīng)激,Bcl-2/Bax比值降低,過(guò)度訓(xùn)練大鼠心肌細(xì)胞凋亡加劇,引發(fā)運(yùn)動(dòng)性心肌損傷。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平及Bax和Bcl-2的H-score結(jié)果Table 3 H-score of cardiomyocyte apoptosis and Bcl-2/Bax in myocardium between rats in each

圖4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平(TUNEL,400×)

圖5 各組大鼠心肌Bcl-2和Bax表達(dá)情況(TUNEL,400×)

本研究還發(fā)現(xiàn),COM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平較OM組極顯著降低(p<0.01),Bcl-2表達(dá)極顯著增加(p<0.01),Bax表達(dá)極顯著減少(p<0.01),Bcl-2/Bax比值極顯著升高(p<0.01)。Calvert等的研究表明[36],提高Nrf2表達(dá)的穩(wěn)定性可以升高Bcl-2水平,說(shuō)明姜黃素可以通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá),改善心肌細(xì)胞凋亡狀態(tài)。Yang等[37]的研究中,使用姜黃素對(duì)大鼠心臟進(jìn)行預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá),減少線(xiàn)粒體氧化損傷,進(jìn)而改善缺血再灌注后的心肌功能。He等[38]的研究認(rèn)為姜黃素可以通過(guò)促進(jìn)Bcl-2易位至線(xiàn)粒體,抑制氧化應(yīng)激,改善線(xiàn)粒體功能,從而降低藥物誘導(dǎo)的心肌損傷。本研究中,與OM組相比,COM組大鼠心肌病理學(xué)變化明顯減輕,血清T/Cor比值極顯著升高(p<0.01),cTnI水平顯著降低(p<0.05)。結(jié)合上述病理特征、損傷指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)和凋亡指標(biāo)的變化,說(shuō)明補(bǔ)充姜黃素可以通過(guò)上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達(dá),提高SOD活性,有效緩解過(guò)度訓(xùn)練及其引發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài),上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax,有效升高Bcl-2/Bax比值,抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程的繼續(xù)發(fā)展,發(fā)揮對(duì)心臟的保護(hù)作用。

2.5 各組大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA濃度變化

長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí),心肌細(xì)胞內(nèi)還原型輔酶I氧化酶、黃嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶等活性增強(qiáng),導(dǎo)致線(xiàn)粒體內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成增多,大量的ROS除了引起線(xiàn)粒體本身發(fā)生損傷,還會(huì)引起整個(gè)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激風(fēng)險(xiǎn)增加[34]。本研究結(jié)果顯示(表4),OM組心肌T-AOC和SOD活性極顯著低于C組(p<0.01),MDA濃度極顯著高于C組(p<0.01);COM組心肌T-AOC和SOD活性極顯著高于OM組(p<0.01),MDA濃度顯著低于OM組(p<0.05)。結(jié)合Nrf2和HO-1表達(dá)變化,表明長(zhǎng)時(shí)程、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制抗氧化酶發(fā)揮生物學(xué)活性,誘導(dǎo)心肌氧化應(yīng)激增強(qiáng)。Nrf2轉(zhuǎn)錄活性降低,造成其下游抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)下降,機(jī)體抗氧化能力也隨之下降,脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多。而補(bǔ)充姜黃素通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá),增強(qiáng)HO-1表達(dá),提高心肌T-AOC和SOD活性,引起MDA濃度顯著降低,改善了心肌抗氧化能力。

表4 各組大鼠心肌T-AOC、SOD活性及MDA濃度Table 4 T-AOC,SOD activity and MDA concentration in myocardium between rats in each

3 結(jié)論

本研究中,8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練引發(fā)大鼠過(guò)度訓(xùn)練,氧化應(yīng)激加劇并加速心肌細(xì)胞凋亡,心肌組織形態(tài)發(fā)生病理性改變并出現(xiàn)功能異常。訓(xùn)練過(guò)程中對(duì)大鼠以200 mg/(kg·d)劑量姜黃素進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù),能夠通過(guò)上調(diào)Nrf-2(p<0.01),增加HO-1(p<0.05)表達(dá),提高T-AOC和SOD活性(p<0.01),降低MDA濃度(p<0.05),有效緩解過(guò)度訓(xùn)練的發(fā)生與發(fā)展及其引發(fā)的氧化應(yīng)激狀態(tài),從而引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加(p<0.01),促凋亡蛋白Bax表達(dá)減少(p<0.01),抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡(p<0.01),保護(hù)心臟組織結(jié)構(gòu)和功能正常。