喬向宇,明 亮,伊 麗,何 靜,吉日木圖,2,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古駱駝研究院,內(nèi)蒙古阿拉善 750306)

急性酒精性肝損傷是酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)的早期發(fā)病形式,ALD的疾病譜包含單純的脂肪變性、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化以及肝細(xì)胞癌,這些病理變化能夠單獨(dú)存在順序發(fā)生,也可以同時(shí)存在或部分重疊[1]。一項(xiàng)基于全球2800萬人的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,飲酒是導(dǎo)致死亡(早逝)和傷殘調(diào)整壽命年(DALYs)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。2016年,全球有約280萬人因飲酒死亡,其中我國(guó)因飲酒導(dǎo)致的死亡人數(shù)就占其中的四分之一,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他國(guó)家[2]。細(xì)胞受損,炎癥應(yīng)答,氧化應(yīng)激[3],腸道內(nèi)微生態(tài)失調(diào)[4]被認(rèn)為是影響酒精性肝損傷的關(guān)鍵因素。

近年來,有研究者利用從自然發(fā)酵駝乳中分離的乳酸菌發(fā)酵鮮駝乳以及鮮牛乳,通過體外測(cè)定抗氧化能力發(fā)現(xiàn),發(fā)酵駝乳具有更強(qiáng)的自由基清除能力,且抗氧化能力顯著高于發(fā)酵牛乳[5]。通過對(duì)益生菌的研究發(fā)現(xiàn),其能夠用于預(yù)防和治療與腸道細(xì)菌產(chǎn)物相關(guān)和腸道泄露相關(guān)的疾病,其中,鼠李糖乳酸桿菌已經(jīng)成功地應(yīng)用于治療酒精誘導(dǎo)的大鼠肝損傷[6]。自然發(fā)酵駝乳中蘊(yùn)含豐富的乳酸菌資源,在保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的肝損傷方面還未有研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究自然發(fā)酵駝乳對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用,并從機(jī)體炎癥應(yīng)答水平、肝臟氧化應(yīng)激程度和脂肪變性三方面初步探討其發(fā)揮作用的機(jī)制,為進(jìn)一步開發(fā)利用自然發(fā)酵駝乳提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)CD-1(ICR)小鼠 雄性,體重(21～23) g,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi),環(huán)境溫度(22±2) ℃,濕度50%～60%,小鼠自由進(jìn)食和飲水,晝夜交替周期為12 h 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;自然發(fā)酵駝乳 內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市所屬的牧區(qū);天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)測(cè)定試劑盒 北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司;腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、總膽固醇(Total Cholesterol,TC)等ELISA測(cè)定試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;95%乙醇溶液(AR)、石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、氨水 上海國(guó)藥集團(tuán);蘇木素、伊紅 BASO公司;中性樹脂 北京索萊寶公司。

ZJ-4IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司;2014-181Ab真空冷凍干燥機(jī) 上海東富龍科技股份有限公司;5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf;3100全自動(dòng)生化分析儀 Hitachi;Bead Ruptor12組織研磨勻漿儀 Omni;SynergyH1多功能微孔板檢測(cè)儀 BioTek;SQ2125石蠟切片機(jī) Leica;PPTHK-21B攤片機(jī) Leica;DS-Ri2顯微圖象分析系統(tǒng) Nikon;GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DK-8AX電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;FE28臺(tái)式pH計(jì) Mettler;各型號(hào)微量加樣器 Eppendorf。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 自然發(fā)酵駝乳的處理 本實(shí)驗(yàn)所用自然發(fā)酵駝乳采自內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市所屬的牧區(qū)。新鮮駝乳經(jīng)采集、簡(jiǎn)單過濾后,65 ℃加熱30 min,并與約3%發(fā)酵好的自然發(fā)酵駝乳(老酸奶)混合均勻后敞口放置于環(huán)境中,自然發(fā)酵3 d之后采集樣品,樣品置于4 ℃冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)測(cè),自然發(fā)酵駝乳的滴定酸度為77.3 °T,pH為5.13。樣品經(jīng)離心脫脂(3500 r/min,40 min)后,真空冷凍干燥成粉,存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物分組、給藥以及造模 24只ICR小鼠待其體重增長(zhǎng)到(38±4) g時(shí),隨機(jī)分為3組(每組8只),即正常組(NC)、模型組(MC)、自然發(fā)酵駝乳組(FCM)。NC組和MC組每日灌胃0.3 mL滅菌ddH2O;FCM組每日灌胃脫脂自然發(fā)酵駝乳粉溶液,按照6 g/kg(BW)的劑量計(jì)算并稱取自然發(fā)酵駝乳粉,溶于0.3 mL滅菌ddH2O中進(jìn)行灌胃。每日灌胃2次,連續(xù)灌胃2周。造模最后一次灌胃結(jié)束后,禁食不禁水6 h,分3次按照總劑量為7.3 g/kg劑量灌胃體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精溶液進(jìn)行造模,間隔1 h(見圖1)[7-9]。酒精灌胃結(jié)束后繼續(xù)禁食不禁水6 h,經(jīng)異氟烷麻醉取血后,頸椎脫臼法處死小鼠進(jìn)行取材。

圖1 造模流程圖

1.2.3 體重及臟器指數(shù)的測(cè)定 小鼠麻醉前,稱取體質(zhì)量,取材后準(zhǔn)確稱取小鼠肝臟濕重,按照下述公式計(jì)算肝臟指數(shù):

1.2.4 血清指標(biāo)(ALT、AST、TNF-α、IL-1β以及IL-6)的檢測(cè) 小鼠眼眶采血后,常溫下靜置4～6 h后離心分離血清(4 ℃,3000 r/min,20 min),用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中ALT和AST的活性,按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量。

1.2.5 肝組織相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè) 取約0.100 g肝組織,按照肝組織∶PBS=1∶9 (m/m)加入預(yù)冷的PBS(pH7.4),置于勻漿儀上進(jìn)行冰浴勻漿,勻漿速度2.90 m/s,勻漿時(shí)間15 s。勻漿完畢后離心(4 ℃,3000 r/min,20 min)收集上清備用。上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)小鼠肝臟組織中MDA、SOD、GSH-Px、以及TG和TC的含量和活性。

1.2.6 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) 肝組織制作石蠟切片進(jìn)行HE染色:將新鮮的肝臟左葉組織邊緣部分切除,PBS沖洗后,將中央均勻的組織切分為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小的組織塊,置于4%多聚甲醛溶液(PFA)中固定48 h。固定后的組織用PBS沖洗,去除殘留的固定液和雜質(zhì)。依次用50%、70%、85%、95%以及無水乙醇進(jìn)行梯度脫水,每個(gè)濃度下脫水2 h。脫水的組織經(jīng)2次二甲苯透明、3次浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊制作為4～7 μm厚的石蠟切片,切片經(jīng)脫蠟、脫水后進(jìn)行HE染色,切片透明后用中性樹脂封片。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)和肝功指標(biāo)的影響

表1的結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組的ALT和AST水平極顯著增加(p<0.01),表明模型組的肝細(xì)胞受損,模型建立成功。模型組的肝臟指數(shù)較正常組有增大的趨勢(shì),但是差異不顯著(p>0.05)。與模型組相比,自然發(fā)酵駝乳組的ALT水平顯著下降(p<0.05),AST具有下降趨勢(shì),但沒有顯著性差異(p>0.05)。自然發(fā)酵駝乳組的肝指數(shù)低于模型組,但是高于對(duì)照組,三組之間均沒有顯著性差異。

表1 小鼠體重,肝臟指數(shù)及肝功指標(biāo)Table 1 Mouse body weight,liver index and serum

2.2 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響

圖2的結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中的TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量均顯著高于對(duì)照組(p<0.05或p<0.01),其中IL-1β和IL-6具有極顯著差異(p<0.01)。與模型組相比,自然發(fā)酵駝乳組小鼠TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量極顯著降低(p<0.01)。此外,自然發(fā)酵駝乳組上述三個(gè)指標(biāo)的含量與正常組相比,均沒有顯著差異(p>0.05)。

圖2 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響

2.3 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量和SOD、GSH-Px活性的影響

表2的結(jié)果顯示,模型組肝臟內(nèi)的MDA含量極顯著高于正常組(p<0.01),這表明短時(shí)間內(nèi)灌胃大量酒精后,小鼠肝臟內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度增加;而自然發(fā)酵駝乳組的MDA含量與模型組相比,顯著降低(p<0.05),這說明灌胃自然發(fā)酵駝乳能夠改善因單次大量飲酒所致的肝臟氧化應(yīng)激水平的增加,能夠顯著降低肝臟內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。與正常組比較,模型組小鼠肝臟內(nèi)SOD的含量顯著降低(p<0.05),這可能是肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激迅速增加，消耗了肝臟中發(fā)揮抗氧化作用的SOD所致;與模型組相比,灌胃了自然發(fā)酵駝乳組的小鼠體內(nèi)SOD活性則顯著增加(p<0.05)。自然發(fā)酵駝乳組GSH-Px的酶活顯著高于模型組(p<0.05),模型組中的含量低于正常組,但差異不顯著(p>0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Soleymanzadeh等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,說明自然發(fā)酵駝乳具有抗氧化作用。

表2 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of naturally fermented camel milk on liver MDA contents,SOD and GSH-Px activities in acute alcoholic liver injury

2.4 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG和TC的影響

由圖3可以得出,模型組小鼠肝臟中TG和TC的含量極顯著升高(p<0.01),這說明在肝細(xì)胞中有脂質(zhì)的積累,這符合急性酒精性肝損傷早期的發(fā)病特征[10]。自然發(fā)酵駝乳組小鼠肝臟中的TG含量則極顯著降低(p<0.01),并且接近于正常水平;TC的含量有降低的趨勢(shì)但差異不顯著(p>0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,灌胃了自然發(fā)酵駝乳后,能夠有效緩解短時(shí)間內(nèi)大量飲酒所致的脂質(zhì)在肝臟中的堆積情況。

圖3 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟TG和TC的影響

2.5 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

如圖4所示,光鏡下可見,正常組小鼠肝細(xì)胞排列較為整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)完整,未見明顯炎癥細(xì)胞(A);模型組肝細(xì)胞排列紊亂,具有明顯水腫現(xiàn)象,有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖中以箭頭標(biāo)注),發(fā)生輕度脂肪變性(B);自然發(fā)酵駝乳組肝細(xì)胞排列較為整齊,無見明顯水腫現(xiàn)象,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少,脂肪變性程度減輕(C)。

圖4 自然發(fā)酵駝乳對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響(HE，200×)

3 討論與結(jié)論

自然發(fā)酵駝乳是指以新鮮駝乳為原料,經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性(主要是乳酸)含乳飲料[11]。具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效,主要流行于非洲、阿拉伯國(guó)家、中亞、印度、蒙古國(guó)以及我國(guó)的新疆、內(nèi)蒙古等地區(qū)[12],并深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏邸?/p>

早前報(bào)道,抗生素或者益生菌的施用能夠降低乙醇喂養(yǎng)的大鼠肝臟病變的嚴(yán)重程度[13-14]。自然發(fā)酵駝乳中益生菌種類豐富、數(shù)量巨大。張哲等[15]基于16S rRNA序列分析以及PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古阿拉善盟傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行研究,從中分離到8株乳酸菌和5株酵母菌,其中乳桿菌為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,克魯維酵母菌屬為優(yōu)勢(shì)真菌屬。孫天松等[16]對(duì)新疆伊犁地區(qū)和蒙古國(guó)采集的發(fā)酵駝乳中乳酸菌和酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),其中乳酸菌數(shù)為6.45×107～1.13×109CFU/mL,酵母菌數(shù)為7.75×102～4.6×107CFU/mL。此外,Forsyth等[6]發(fā)現(xiàn)灌胃益生菌能夠預(yù)防和治療與腸道細(xì)菌產(chǎn)物相關(guān)的疾病并抑制腐敗菌的繁殖、增加腸道內(nèi)益生菌的含量。長(zhǎng)期灌胃益生菌數(shù)目巨大的自然發(fā)酵駝乳是否具有同樣的作用,仍需進(jìn)一步研究。

促炎細(xì)胞因子TNF-α以及IL-1β在ALD中發(fā)揮重要作用[17-18]。近些年的研究表明,ALD小鼠的腸道微生態(tài)平衡被打破[19-20],腸道通透性的增加使得內(nèi)毒素(LPS)進(jìn)入機(jī)體[21],通過與肝臟Kupffer細(xì)胞表面的TLR4(Toll-like Receptor 4)結(jié)合后,通過一系列生物化學(xué)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3,22]來促進(jìn)上述細(xì)胞因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示,自然發(fā)酵駝乳能夠顯著降低乙醇誘導(dǎo)的酒精性肝損傷小鼠血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6炎癥因子的含量。該結(jié)果表明,自然發(fā)酵駝乳能夠逆轉(zhuǎn)急性酒精性肝損傷小鼠體內(nèi)的炎癥應(yīng)答情況,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與小鼠肝臟病理切片HE染色的結(jié)果相吻合。

氧化應(yīng)激是早期ALD的關(guān)鍵機(jī)制之一,大量研究表明,乙醇的攝入會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加,這個(gè)過程會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,如丙二醛、4,4-羥基壬烯醛等[23]和自由基,如ROS和1-羥乙基自由基(HER)等,這些都是具有肝毒性的物質(zhì)。但是由于生物體內(nèi)有抗氧化物質(zhì)(包括抗氧化酶類、非酶抗氧化劑如GSH、維生素E以及維生素C等)的存在,使得機(jī)體有一定的抗氧化和自由基清除能力。Beermann[24]等研究發(fā)現(xiàn),運(yùn)用乳酸菌水解乳酪蛋白,能夠從中獲得具有抗氧化活性的物質(zhì)。烏仁圖雅等[25]研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵駝乳能夠顯著降低小鼠血清、肝臟中MDA的含量,并提高肝臟、骨骼肌中T-SOD和GSH-Px活力,具有較強(qiáng)的抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵駝乳組肝臟中MDA含量顯著降低(p<0.05),而SOD和GSH-Px的活性顯著增加(p<0.05)。該結(jié)果說明,自然發(fā)酵駝乳能夠抑制小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),并提高其抗氧化能力,改善氧化應(yīng)激,進(jìn)而減輕肝損傷。

此外,研究表明乙醇誘導(dǎo)的急性肝損傷前期氧化應(yīng)激的增加,使得肝細(xì)胞內(nèi)正常的脂代謝通路受到破壞[26-27],脂質(zhì)在肝臟中的積累,進(jìn)而發(fā)生脂肪變性。過氧化物酶體增殖物激活受體-α(Peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α)是一種核激素受體,參與肝臟脂肪酸β氧化過程,并控制涉及脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化作用等一系列基因的轉(zhuǎn)錄,Zn元素被認(rèn)為是PPAR-α的激動(dòng)劑[10]。據(jù)報(bào)道,鮮駝乳中富含F(xiàn)e、Zn、Cu等微量元素,其中以Zn元素的含量最高[28]。Bahobail等[29]和Meldebekova等[30]發(fā)現(xiàn)鮮駝乳經(jīng)過發(fā)酵后Zn元素的含量增加,從0.8 mg/100 g增加到0.99 mg/100 g[29]。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵駝乳組小鼠肝臟中的TG含量明顯降低(p<0.01),結(jié)合肝組織病理切片結(jié)果也可以說明,自然發(fā)酵駝乳能夠減輕急性酒精性肝損傷前期的脂肪變性程度。我們推測(cè),自然發(fā)酵駝乳中富含的Zn元素可能使其能夠促進(jìn)肝臟內(nèi)脂肪的氧化作用,進(jìn)而促進(jìn)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),并最終使得肝臟中TG的含量降低。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自然發(fā)酵駝乳能夠保護(hù)小鼠肝臟免受乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。這種保肝護(hù)肝作用可能是通過抑制小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)、改善小鼠肝臟氧化應(yīng)激程度以及減輕小鼠肝臟脂肪變性程度,從而使得肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常來實(shí)現(xiàn)的。本研究的不足之處在于,未明確自然發(fā)酵駝乳中發(fā)揮保肝護(hù)肝作用的具體成分以及自然發(fā)酵駝乳中微生物的種類和構(gòu)成,這兩個(gè)問題有待進(jìn)一步深入研究。