母健菲,趙 欣,龍興瑤,3,周先容,潘妍霓,3,劉必慧,*

(1.重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,重慶 400067;2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;3.車醫(yī)科學(xué)大學(xué)食品生命工學(xué)專業(yè),韓國(guó)京畿道 487-010)

小葉苦丁茶又稱作“青山綠水”,其原植物為木犀科女貞屬的粗壯女貞及其同屬植物麗葉女貞、總梗女貞等,廣泛分布于中國(guó)西南地區(qū),尤其是貴州、四川和云南。研究表明,小葉苦丁茶具有保健功效,其功能性成分主要包括萜類、多酚類、苯丙素類、黃酮類物質(zhì)[1]。由于這些功能性成分的存在,小葉苦丁茶具有散風(fēng)熱、清頭明目、生津止渴、降血壓、降血脂、降低膽固醇、抗菌消炎以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[1-2]。小葉苦丁茶多酚是從茶葉中提取的一類非常重要的成分,包括兒茶素類、黃酮類和酚酸類等[3],有研究表明小葉苦丁茶的降血脂、保肝等活性及清熱解毒的傳統(tǒng)療效與其具有很強(qiáng)的抗氧化活性密切相關(guān),而大葉苦丁茶的功效與其具有很強(qiáng)的抗菌及抗炎活性相關(guān)。小葉苦丁茶多酚對(duì)氧自由基有很強(qiáng)的清除能力,能攫取在新陳代謝作用和脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基,并轉(zhuǎn)化成活性較低的自由基,破壞自由基氧化鏈反應(yīng),同時(shí)茶多酚能夠激活和提高機(jī)體中許多抗氧化酶(如 SOD、GSH、CAT等)的活性,高效清除自由基[4-5]。天然植物中包含多酚在內(nèi)的多種抗氧化成分,已經(jīng)逐步被應(yīng)用于抗氧化保健產(chǎn)品的開發(fā)中。

胃是人體重要的消化器官,胃部疾病主要表現(xiàn)為胃損傷,常出現(xiàn)胃不適、胃痛甚至胃出血等癥狀,臨床表現(xiàn)為胃酸過(guò)多、胃部灼燒、消化不良、腹部疼痛等。酒精、刺激性物質(zhì)以及一些藥物可能引起胃損傷[6]。近年來(lái),酒精引發(fā)的疾病發(fā)病率明顯增加,其中酒精性胃炎尤為突出,主要原因是酒精進(jìn)入胃部,刺激胃粘膜,增加上皮組織細(xì)胞膜通透性,破壞胃粘膜屏障導(dǎo)致?lián)p傷。同時(shí),酒精還會(huì)刺激胃組織,造成其嚴(yán)重蠕動(dòng),并引起機(jī)械損傷[7]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,是體內(nèi)唯一一種能夠清除超氧陰離子的酶類物質(zhì),其活力能夠反映機(jī)體清除自由基的能力,在抗氧化方面起著重要作用[8-9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物,可以破壞核酸、蛋白等生物大分子,造成機(jī)體損傷和疾病的發(fā)生,其產(chǎn)生還能加劇膜的損傷,可通過(guò)MDA了解膜脂過(guò)氧化的程度,間接測(cè)定膜系統(tǒng)的受損程度[10-11]。CAT是機(jī)體中一種重要的抗氧化酶,與SOD在機(jī)體內(nèi)保持著動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[12-13],機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)以上物質(zhì)就會(huì)受到影響。此外,機(jī)體炎癥因子隨機(jī)體也會(huì)發(fā)生改變,誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)都是炎癥相關(guān)基因,正常生理?xiàng)l件下,在多數(shù)器官中均檢測(cè)不到表達(dá),當(dāng)機(jī)體受到各種病理刺激或損傷時(shí),兩者都會(huì)被迅猛誘導(dǎo),表達(dá)量迅速上升[14-15]。NOS的另外兩種神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是通過(guò)其s編碼基因和對(duì)鈣的依賴性進(jìn)行區(qū)別的,主要存在于上皮和血小板中,兩者可產(chǎn)生NO對(duì)機(jī)體進(jìn)行調(diào)節(jié)。以上四種基因的表達(dá)升高或降低的特性可以作為判斷炎癥和組織損傷的標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。有相關(guān)研究表明,茶多酚具有“七抗(抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗輻射、抗病毒、抗過(guò)敏、抗菌)、三降(降血脂、降血糖、降體重)、二防、(防動(dòng)脈粥樣硬化、防老年癡呆)、一解(解毒)”功能[3],其作用機(jī)制主要是茶多酚能夠顯著減少中性粒細(xì)胞的滲透物、腫瘤壞死因子-α,可有效減少血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、IL-6水平,并且可以在一定程度上降低多形核白細(xì)胞的滲透、IκBa的磷酸化,增加SOD活性,防止反應(yīng)氮、氧自由基對(duì)細(xì)胞、DNA的功能結(jié)構(gòu)造成損傷,進(jìn)而有效防治急性炎癥,減少刺激性物質(zhì)對(duì)機(jī)體組織的損壞[18-19]。小葉苦丁茶含有多酚類物質(zhì)種類較多,含量也豐富,且不同地區(qū)產(chǎn)小葉苦丁茶的多酚種類和含量也存在差異,并且苦丁茶的使用范圍有限,目前針對(duì)其生物活性作用的研究不夠深入,缺乏動(dòng)物體內(nèi)研究、臨床研究和深入的分子層面的機(jī)制研究。

本文以小葉苦丁茶多酚提取物為研究對(duì)象,利用酒精與鹽酸對(duì)胃的疊加損傷作用,建立小鼠胃損傷模型,觀察小葉苦丁茶多酚對(duì)酒精鹽酸溶液誘導(dǎo)小鼠胃損傷的預(yù)防作用,以期為小葉苦丁茶保健功能的開發(fā)利用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小葉苦丁茶 安徽省蕪湖市徽茶品茶業(yè)有限公司;沒(méi)食子酸、福林-酚試劑、ABTS 都萊生物-中國(guó)生化試劑網(wǎng);DPPH 南京化成工業(yè)株式會(huì)社;總超氧化物歧化酶(SOD測(cè)定試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;DNase/Rnase-Free Water 北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑、SYBR Select Master Mix、RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit 美國(guó)Life techmologies公司;qPCR引物COX-2、iNOS、eNOS、nNOS、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、GAPDH 美國(guó)Thermo Scientific公司;其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;清潔級(jí)6周齡雄性昆明小鼠50只(體質(zhì)量20～25 g) 購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證SCXK(渝)2017-0001),在控溫(22±4) ℃并保濕(50±20)%條件下,用標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),自由飲水,1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

LUX多功能性酶標(biāo)儀、StepOne Plus定量PCR儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷凍離心機(jī)、MPC-P25微孔板離心機(jī)、Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀、Nano-300微量分光光度計(jì) 杭州奧盛儀器有限公司;OLYMPUS-BX43生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司;LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小葉苦丁茶茶多酚的提取 參考胡蓉[20]的多酚提取工藝,略有改動(dòng)。稱取100 g小葉苦丁茶打碎成粉,加入400 mL的45%(V/V)乙醇溶液,90 ℃浸提30 min,再重復(fù)1次,收集2次浸提液后調(diào)節(jié)提取液pH至6.0,然后加入160 mL 的AlCl3(6 g)和ZnCl2(12 g)混合沉淀劑進(jìn)行沉淀,接著對(duì)混合液進(jìn)行離心分離(3000 r/min、10 min),將200 mL鹽酸(12%,V/V)加入收集到的沉淀中轉(zhuǎn)溶,分離出上清液,分別加入2次200 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取。最后對(duì)萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60 ℃)得到多酚提取物干物質(zhì)。

1.2.2 小葉苦丁茶多酚含量的測(cè)定 分別取1、2、3、4、5 mL已知濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)食子酸溶液溶于蒸餾水中,配制成不同濃度的沒(méi)食子酸溶液,按Folin-Ciocalteu比色法[21]在1 mL不同濃度的沒(méi)食子酸溶液中加入3 mL的Folin-Ciocalteu顯色劑和4.5 mL的飽和Na2CO3溶液后定容至25 mL。取顯色后溶液于747 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶于蒸餾水中采用以上方法測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得小葉苦丁茶多酚的含量。

1.2.3 小葉苦丁茶多酚的體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 清除DPPH活性的測(cè)定 DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,常應(yīng)用于抗氧化物對(duì)自由基清除能力的測(cè)定[22-23]。取3.9 mL 25 μg/mL DPPH溶液分別與100 μL 200、400、600和800 μg/mL的SCKPE(small-leaf kudingcha polyphenol extract)溶液混勻(A1),取3.9 mL無(wú)水乙醇與分別與100 μL濃度為200、400、600和800 μg/mL的SCKPE溶液混勻(A2),取3.9 mL濃度為25 μg/mL DPPH溶液與100 μL80%甲醇溶液混勻(A3),然后室溫下暗處?kù)o止反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品平均三次,取平均值,以100 μL濃度為200、400、600和800 μg/mL維生素C(VC)為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算清除率,公式如下:

1.2.3.2 清除ABTS活性的測(cè)定 根據(jù)Ren等[24]的方法,取5 mL 7 mmoL/L ABTS溶液和88 μL 140 mmoL/L的過(guò)硫酸鉀溶液避光反應(yīng)12 h,用時(shí)再用無(wú)水乙醇稀釋到在波長(zhǎng)為732 nm光下吸光值為0.70±0.02。取5 mL ABTS反應(yīng)液分別與200 μL 200、400、600和800 μg/mL的SCKPE溶液混勻(A1),取5 mL無(wú)水乙醇與分別與200 μL濃度為200、400、600和800 μg/mL的SCKPE溶液混勻(A0),取5 mL濃度為ABTS反應(yīng)液與200 μL 80%甲醇溶液混勻(A空),在室溫下避光反應(yīng)6 min,在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定吸光度。重復(fù)三次取平均值,以200 μL濃度為200、400、600和800 μg/mL VC為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算清除率,公式如下:

1.2.3.3 清除羥自由基活性的測(cè)定 根據(jù)Zhang等[25]的方法,取300 μL 80%甲醇溶液加入2 mL FeSO4(9 mmol/L)和50%水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L)1.0 mL,再加入H2O2(8.8 mmol/L)1.0 mL混勻(A0);反應(yīng)混合物(Ai)(4.30 mL)含F(xiàn)eSO4(9 mmol/L)2.0 mL、H2O2(8.8 mmol/L)1.0 mL、樣品溶液(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)0.3 mL、50%水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L)1.0 mL;反應(yīng)混合物(Aj)(4.30 mL)含F(xiàn)eSO4(9 mmol/L)2.0 mL、1.0 mL 80%甲醇、樣品溶液(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)0.3 mL、50%水楊酸乙醇溶液(9 mmol/L)1.0 mL。最后將反應(yīng)混合液置于37 ℃水浴鍋中加熱1 h后,吸取200 μL最終反應(yīng)液于96孔板中在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。重復(fù)三次取平均值,以0.3 mL(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL)VC為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算清除率,公式如下:

1.2.3.4 還原力的測(cè)定 采用鐵離子還原力測(cè)定法[26],分別取200 μL不同濃度(200、400、600、800 μmol/L)的VC溶液和樣品液,各加入0.2 mol/L pH6.6的PBS緩沖液2.5 mL,分別加入2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液充分混勻,置于50 ℃水浴鍋加熱20 min,取出快速冷卻。加入2.0 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸,進(jìn)行終止反應(yīng)。分別取混合液與2.5 mL蒸餾水混勻,再加入0.5 mL 0.1%的三氯化鐵,充分混合,并在室溫下靜置10 min。對(duì)照組用2.5 mL甲醇溶液反應(yīng)的混合液代替VC溶液和樣品液。于700 nm處測(cè)定吸光度。重復(fù)三次取平均值,以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將小鼠平均分為5組,每組10只,分別為正常組、模型組、雷尼替丁灌胃組(50 mg/kg)、SKCPE低濃度組(100 mg/kg)、SKCPE高濃度組(200 mg/kg)。正常組和模型組小鼠不作任何處理;雷尼替丁灌胃組每天50 mg/kg灌胃雷尼替丁溶液0.2 mL;SKCPE灌胃高、低濃度組小鼠每天按200和100 mg/kg分別灌胃SKCPE溶液0.2 mL,以上灌胃進(jìn)行14 d,每次灌胃都使用12號(hào)灌胃針通過(guò)小鼠口腔緩慢插入食道,不對(duì)小鼠胃部造成機(jī)械損傷。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由攝食和飲水,每天進(jìn)行稱重,記錄飲食、飲水量。第14 d灌胃上述樣品后對(duì)小鼠進(jìn)行禁食,但允許自由飲水。禁食24 h后,第15 d以60%的酒精和40%150 mmol/L鹽酸混合液為誘導(dǎo)劑,按小鼠體重每10 g灌胃0.1 mL對(duì)小鼠進(jìn)行胃損傷誘導(dǎo)[27](正常組不誘導(dǎo))。誘導(dǎo)0.5 h后,眼球取血并取胃組織用一次性注射器吸出胃液測(cè)定胃液量和胃液pH。

1.2.5 小鼠胃損傷水平測(cè)定 小鼠解剖后取胃組織平鋪拍照,通過(guò)ImageJ 1.44軟件測(cè)定胃損傷面積,根據(jù)公式計(jì)算抑制率,對(duì)各組小鼠胃組織損傷程度進(jìn)行分析。

抑制率(%)=(模型組小鼠胃損傷面積-試驗(yàn)組小鼠胃損傷面積)/模型組小鼠胃損傷面積×100

1.2.6 小鼠血清及胃組織水平測(cè)定 將小鼠血漿于4 ℃、4000 r/min離心10 min收集血清,按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定小鼠血清以及胃組織勻漿液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量。

1.2.7 胃組織病理學(xué)觀察 取小鼠胃組織于裝有10%的福爾馬林溶液中進(jìn)行固定,并用不同濃度乙醇脫水,用二甲苯置換胃組織中乙醇使組織透亮,再用石蠟包埋切片,采用H&E染色法對(duì)切片染色,并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.8 qPCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠胃組織mRNA表達(dá) 取小鼠胃組織100 mg勻漿,用Trizol試劑提取胃組織細(xì)胞中總RNA,通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度并稀釋為1 μg/mL,取2 μL稀釋后的總RNA提取液,依次加入1 μL的OligodT18、RNase、dNTP、MLV酶和10 μL的5×Buffer,在37 ℃ 120 min,99 ℃ 4 min,4 ℃ 3 min條件下合成cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增nNOS、eNOS、iNOS、COX-2、Mn-SOD、Gu/Zn-SOD和CAT(引物表1),同時(shí)以持家基因(GAPDH)作為內(nèi)參照按同樣條件進(jìn)行擴(kuò)增。用ImageJ 1.44軟件進(jìn)行半定量分析[28]。

表1 引物的序列Table 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)每只小鼠的血清和組織測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)后取平均值,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-Way ANOVA 法進(jìn)行單因素方差分析,多組均數(shù)的兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn),分析各組數(shù)據(jù)在p<0.05水平上相互是否具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉苦丁茶多酚提取物的含量

按照1.2.2方法繪制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.7059x-0.2294(R2=0.9983),小葉苦丁茶多酚吸光度為0.792,通過(guò)計(jì)算得小葉苦丁多酚提取物含量為5.082 μg/ml。

2.2 小葉苦丁茶多酚提取物體外抗氧化效果

2.2.1 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的DPPH自由基清除能力 DPPH自由基有單電子體,當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失,其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系,從而間接定量自由基清除劑的含量。樣品對(duì)DPPH自由基清除能力的大小可反映該樣品抗氧化能力的大小[29]。由圖1可以看出,小葉苦丁茶和VC在一定濃度范圍內(nèi)都對(duì)DPPH有一定的清除作用,隨著濃度的增加對(duì)DPPH清除能力也增強(qiáng)。從整個(gè)濃度增加趨勢(shì)看,VC對(duì)DPPH自由基的清除率緩慢增強(qiáng),小葉苦丁茶多酚對(duì)DPPH的清除率在600 μg/mL處急劇上升,當(dāng)濃度800 μg/mL 時(shí),小葉苦丁茶多酚的清除能力達(dá)到32.15%,VC的清除能力達(dá)到11.56%。由此說(shuō)明小葉苦丁茶多酚對(duì)DPPH的清除能力較VC強(qiáng)。

圖1 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的DPPH自由基清除能力

2.2.2 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的ABTS自由基清除能力 ABTS法用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定,在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+·,在抗氧化物存在時(shí)ABTS+·的產(chǎn)生受到抑制,自由基減少,使其藍(lán)綠色褪去,褪色越明顯,表明該物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)[30]。由圖2可以看出,不同的樣品不同的濃度對(duì)ABTS自由基有不同的清除效率,清除率和質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的關(guān)系。在相同條件下,小葉苦丁茶多酚的ABTS自由基清除率均高于VC。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),當(dāng)樣品濃度為800 μg/mL時(shí),小葉苦丁茶多酚和VC對(duì)ABTS自由基的清除率分別為37.47%和25.88%。由此說(shuō)明小葉苦丁茶多酚對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除能力,清除效果優(yōu)于同濃度下的VC。

圖2 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的ABTS自由基清除能力

2.2.3 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的羥自由基清除能力 自由基損傷機(jī)體的心、腦、肝等細(xì)胞組織,是機(jī)體產(chǎn)生某些疾病和衰老癥狀的主要原因,尤其是羥自由基對(duì)機(jī)體的損傷尤為嚴(yán)重[31]。羥自由基屬于活性氧的一種,能導(dǎo)致許多有害效應(yīng),當(dāng)加入羥自由基去除劑時(shí),去除效果顯著。實(shí)驗(yàn)對(duì)小葉苦丁茶多酚和VC在2、4、6、8 mg/mL的濃度條件下對(duì)羥基自由基的清除能力進(jìn)行分析。由圖3可看出,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,各樣品對(duì)羥自由基的清除率逐漸加強(qiáng),在濃度為8 mg/mL時(shí),小葉苦丁茶多酚和VC的清除率最高,分別為48.40%和44.32%,由此表明小葉苦丁茶多酚清除率明顯高于VC。

圖3 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的羥自由基清除能力

2.2.4 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的鐵離子還原能力 還原能力能夠表征物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中給出電子自身發(fā)生氧化的能力,通過(guò)三價(jià)鐵離子還原法觀察物質(zhì)的還原能力,以吸光度表示結(jié)果,吸光度值越大,說(shuō)明樣品的還原能力越強(qiáng)[32]。由圖4可看出,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,吸光度逐漸增加,即還原力逐漸增強(qiáng)。在濃度為200 μg/mL時(shí),小葉苦丁茶多酚的還原力與VC相近,但小于VC;在濃度為800 μg/mL時(shí),小葉苦丁茶和VC較200 μg/mL時(shí)的還原力有所上升,上升趨勢(shì)較緩慢,VC隨濃度增加還原力增強(qiáng),且趨勢(shì)較明顯?？傮w上看,VC、小葉苦丁茶多酚的還原力與濃度呈正相關(guān),變化趨勢(shì)為VC強(qiáng)于小葉苦丁茶多酚。

圖4 小葉苦丁茶多酚提取物(SKCPE)的鐵離子還原力

2.3 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)胃損傷小鼠胃損傷水平的影響

小鼠經(jīng)鹽酸/乙醇誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后,小鼠胃部上皮頂端胞漿膜受到破壞,細(xì)胞脫落,出現(xiàn)糜爛和潰瘍,損傷嚴(yán)重則會(huì)累及血管引起胃出血,并引起胃黏膜上皮層發(fā)生改變[33-34]。由圖5可知,與正常組相比,模型組小鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯的糜爛和出血,而SKCPE低劑量組、SKCPE高劑量組和雷尼替丁組小鼠胃黏膜的出血和糜爛面積均明顯小于模型組,損傷程度為SKCPE低劑量組>SKCPE高劑量組>雷尼替丁組。

圖5 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃黏膜損傷小鼠的胃外觀觀察

由圖5和表2可知,胃損傷模型組小鼠的損傷程度顯著高于其余組(p<0.05)。藥物治療雷尼替丁組小鼠的胃損傷程度顯著低于SKCPE高、低劑量組和模型組,抑制率顯著高于SKCPE高、低劑量組和模型組(p<0.05),SKCPE高、低劑量組小鼠的胃損傷程度顯著低于模型組,抑制率顯著高于模型組(p<0.05),SKCPE高劑量組的抑制率達(dá)到40.54%,與雷尼替丁組相差21.62%。由此可知,小葉苦丁茶多酚對(duì)小鼠胃損傷有一定的預(yù)防作用,SKCPE高劑量組的效果更為顯著。

表2 小葉苦丁茶多酚提取物治療鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃損傷小鼠的胃損傷程度Table 2 Gastric injury levels of HCl-ethanol-induced gastric injury in rats with polyphenols of small-leaved kudingcha extract treatment

2.4 小葉苦丁茶多酚對(duì)胃損傷小鼠胃液量和胃液pH的影響

小鼠胃受到刺激和損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)胃液分泌過(guò)多,胃酸pH下降[35]。由表3可知,與正常組相比,模型組、SKCPE高、低劑量組和雷尼替丁組的胃液量顯著增加(p<0.05),胃液pH顯著降低(p<0.05),模型組pH最低為1.70±0.67,而雷尼替丁組和SKCPE高劑量組小鼠的胃液量和胃液pH不存在顯著性差異,都與正常組的各項(xiàng)指標(biāo)更為接近。由此說(shuō)明,小葉苦丁茶多酚對(duì)小鼠胃液量分泌及胃液pH以及對(duì)小鼠胃部黏膜具有一定的保護(hù)作用,其中高劑量的SKCPE與雷尼替丁對(duì)小鼠胃損傷的預(yù)防保護(hù)效果相近。

表3 各組小鼠的胃液量及胃液pH Table 3 Gastric fluid volume and gastric juice pH of each group of mice

2.5 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織病理學(xué)變化的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察由鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃損傷小鼠的胃組織病理切片如圖6所示。正常組小鼠胃粘膜組織結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)充血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[36];模型組小鼠胃粘膜大量上皮細(xì)胞脫落,腺體結(jié)構(gòu)雖未受到破壞,但細(xì)胞受損嚴(yán)重,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),區(qū)域內(nèi)可見較多紅細(xì)胞,充血情況嚴(yán)重;雷尼替丁組小鼠胃粘膜同模型組相比損傷情況明顯改善;低濃度小葉苦丁茶多酚灌胃組小鼠胃粘膜組織結(jié)構(gòu)變化同模型組相比,仍有上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)脫落,但胃粘膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度顯著降低,紅細(xì)胞數(shù)量也明顯減少,損傷狀況有所緩解;高濃度小葉苦丁茶多酚灌胃組小鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)比較完整,炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞數(shù)量明顯下降,較低濃度組改善程度更明顯。由此可看出,小葉苦丁茶多酚對(duì)小鼠胃損傷有預(yù)防作用,并存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖6 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃損傷小鼠的胃組織形態(tài)學(xué)變化的影響(200×)

2.6 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠血清及胃組織SOD、GSH、MDA水平的影響

從表4、表5可知,正常組小鼠血清及胃組織中SOD活性和GSH含量均最高,脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA含量最低,而模型組小鼠血清及胃組織中SOD活性、GSH含量和MDA含量與正常組相反,并存在顯著性差異(p<0.05)。低劑量小葉苦丁茶多酚灌胃組小鼠的SOD、GSH水平與正常組相比顯著降低(p<0.05),但與模型組相比其SOD活性和GSH含量顯著上升(p<0.05),MDA含量在血清和胃組織中都顯著低于模型組、高于正常組(p<0.05)。高劑量小葉苦丁茶多酚灌胃小鼠血清及胃組織中SOD活性和GSH含量較低劑量組顯著升高(p<0.05),MDA含量顯著降低(p<0.05),各指標(biāo)水平與雷尼替丁組灌胃小鼠相當(dāng),都趨近于正常組水平。高劑量組小鼠血清中SOD與正常組僅相差33.04 U/mL,組織中僅相差6.96(U/mg prot);雷尼替丁組小鼠的SOD、MDA、GSH水平都顯著優(yōu)于模型組和高、低小葉苦丁茶多酚灌胃組小鼠,基本接近正常組。由此可看出,小葉苦丁茶多酚能顯著上調(diào)胃損傷小鼠血清及胃組織中SOD活性和GSH含量,下調(diào)MDA含量,且濃度越高,效果越顯著。

表4 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠血清SOD、GSH、MDA水平的影響Table 4 Effect of SKCPE on the level of SOD,GSH,MDA in serum of mice

表5 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織SOD、GSH、MDA水平的影響Table 5 Effect of SKCPE on the level of SOD,GSH,MDA in gastric tissue of mice

2.7 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.7.1 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)的影響 從表6可知,與正常組相比,模型組和經(jīng)處理過(guò)的SKCPE低劑量組、SKCPE高劑量組和雷尼替丁組中CAT、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD的表達(dá)量均顯著降低(p<0.05)。其中模型組中相對(duì)表達(dá)量最低,小葉苦丁茶多酚高、低劑量組中Mn-SOD、CAT表達(dá)量都顯著高于模型組低于正常組,且與模型組之間存在顯著差異(p<0.05),小葉苦丁茶多酚低劑量組小鼠胃組織中CuZn-SOD在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量與模型組不存在顯著性差異,但SKCPE低劑量組的相對(duì)表達(dá)量(1.53±0.38)高于模型組。SKCPE低、高劑量組中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)存在顯著性差異(p<0.05),且高劑量組相對(duì)表達(dá)量高于低劑量組。雷尼替丁組與正常組小鼠胃組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA表達(dá)存在顯著性差異(p<0.05),但與SKCPE高劑量組不存在顯著性差異。由此說(shuō)明,小葉苦丁茶多酚能顯著提高由鹽酸/乙醇誘導(dǎo)的胃損傷小鼠模型胃組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT的表達(dá)量,高劑量的小葉苦丁茶多酚對(duì)小鼠胃損傷的預(yù)防效果與雷尼替丁效果相當(dāng),均能有效降低小鼠胃損傷程度。

表6 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT相對(duì)表達(dá)量的影響Table 6 Effect of polyphenols of SKCPE on Cu/Zn-SOD,Mn-SOD,CAT relative experssion in gastric tissue of mice

2.7.2 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織中eNOS、nNOS、iNOS、COX-2 mRNA表達(dá)的影響 胃損傷模型小鼠胃組織相關(guān)炎癥因子相對(duì)表達(dá)量如表7所示。由表7可知,模型組的iNOS和COX-2表達(dá)最強(qiáng)(p<0.05),正常組的表達(dá)最弱;小葉苦丁茶多酚灌胃小鼠胃組織中iNOS和COX-2基因的 mRNA 表達(dá)量與其他組具有顯著性差異(p<0.05),小葉苦丁茶多酚灌胃組iNOS和COX-2的相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組,其中高劑量組顯著低于低劑量組(p<0.05),灌胃組和陽(yáng)性藥物雷尼替丁組高于正常組。eNOS和nNOS的相對(duì)表達(dá)量則與iNOS和COX-2相反,正常組的相對(duì)表達(dá)量最高,模型組最低,小葉苦丁茶多酚灌胃組的表達(dá)量均顯著高于模型組(p<0.05),低于正常組和陽(yáng)性藥物雷尼替丁組(p<0.05),SKCPE高劑量灌胃組小鼠的eNOS和nNOS的相對(duì)表達(dá)量顯著高于SKCPE低劑量組(p<0.05),且與雷尼替丁組小鼠的相對(duì)表達(dá)量差距較小。由此說(shuō)明小葉苦丁茶多酚能較好地抑制炎癥,對(duì)鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃損傷模型小鼠胃組織具有保護(hù)作用,在高濃度時(shí)效果更佳。

表7 小葉苦丁茶多酚提取物對(duì)小鼠胃組織中eNOS、nNOS、iNOS、COX-2相對(duì)表達(dá)量的影響Table 7 Effect of polyphenols of SKCPE on eNOS,nNOS,iNOS,COX-2 relative experssion in gastric tissue of mice

3 結(jié)論

本研究以小葉苦丁茶多酚提取物作為研究對(duì)象,測(cè)定其在體外的抗氧化效果,觀察了SKCPE對(duì)鹽酸/乙醇誘導(dǎo)胃損傷的預(yù)防作用,針對(duì)其多酚物質(zhì)的胃損傷預(yù)防效果進(jìn)行了相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平研究,從胃損傷抑制率、胃液分泌量、胃液pH、胃組織病理切片、血清及胃組織中SOD活性和GSH、MDA含量、胃組織中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT、eNOS、nNOS、iNOS、COX-2的mRNA表達(dá)等方面進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,SKCPE有較強(qiáng)的體外抗氧化能力,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中相對(duì)模型組小鼠,SKCPE能抑制鹽酸/酒精對(duì)小鼠胃組織造成的影響,緩解胃黏膜受損,使小鼠機(jī)體各項(xiàng)指標(biāo)向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變,充分展示了SKCPE可以降低鹽酸/乙醇誘導(dǎo)的胃損傷程度,且存在質(zhì)量效應(yīng)關(guān)系,高濃度小葉苦丁茶多酚的作用更為強(qiáng)烈?；隗w外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,小葉苦丁茶多酚提取物作為有效的天然活性物質(zhì),對(duì)胃損傷有顯著預(yù)防效果,其作用機(jī)理和人體實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步挖掘。