鄭 宇,侯彤瑤,王宗義,*,李德美,李虎軍,張竹琴,張亞?wèn)|

(1.北京農(nóng)學(xué)院,食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量安全北京實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京北農(nóng)葡萄酒工程技術(shù)中心,北京 102206;2.北京拓普威釀酒科技有限公司,北京 102413)

硒是一種具有抗氧化[1]、拮抗重金屬[2]和抗癌[3]等多種生理功效的微量元素,硒缺乏[4-5]或過(guò)量[6]均會(huì)致病。最新調(diào)查顯示,我國(guó)31%～69%的居民硒攝入量不足[7]。富硒食品是提高我國(guó)居民硒攝入量的一個(gè)重要途徑。食品中硒可大體分為有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒,前者如硒蛋白、硒代氨基酸,后者如硒酸鈉、亞硒酸鈉,其中有機(jī)硒毒性低,且有更好的吸收率和利用率[8-9]。因此,硒相關(guān)檢測(cè)方法的建立,對(duì)評(píng)價(jià)富硒食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和質(zhì)量安全,指導(dǎo)相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有重要意義。

目前,食品中硒的檢測(cè)方法主要有氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HG-AFS)、熒光分光光度法(FS)[10]、石墨爐原子吸收光譜法(GF-AAS)[11]、氣相色譜法(GC)[12]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[10,13-14],其中FS、GC法需要進(jìn)行衍生,GF-AAS易在石墨爐灰化階段造成硒損失而影響檢測(cè)結(jié)果[15],應(yīng)用報(bào)道較多的是HG-AFS和ICP-MS。無(wú)機(jī)硒、有機(jī)硒等形態(tài)分析,則需要高效液相色譜(HPLC)與HG-AFS、ICP-MS等進(jìn)行聯(lián)用解決[16-17],成本較高。對(duì)樣品進(jìn)行提取[18-19],HG-AFS測(cè)定無(wú)機(jī)硒,再通過(guò)總硒扣除無(wú)機(jī)硒來(lái)計(jì)算有機(jī)硒的方法較為簡(jiǎn)單,成本低,但提取液中的硒代氨基酸等有機(jī)硒能使無(wú)機(jī)硒的檢出結(jié)果偏高,降低結(jié)果的可靠性。本文針對(duì)釀酒葡萄樣品,擬通過(guò)優(yōu)化消解還原條件和無(wú)機(jī)硒的提取分離方法,建立總硒、無(wú)機(jī)硒的檢測(cè)方法,提高總硒測(cè)定的穩(wěn)定性,克服硒代氨基酸對(duì)無(wú)機(jī)硒測(cè)定的干擾,并對(duì)施用富硒葉面肥的釀酒葡萄與釀造產(chǎn)物進(jìn)行了追蹤檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三個(gè)品種的施硒肥釀酒葡萄、對(duì)照釀酒葡萄、酒渣、酒泥和成品葡萄酒 由北京拓普威葡萄酒公司采樣提供,于冰箱中冷凍儲(chǔ)存。其中美樂葡萄樣品6個(gè),對(duì)照樣3個(gè),水分含量為72.90%;品麗珠葡萄樣品4個(gè),對(duì)照樣2個(gè),水分含量74.48%;霞多麗葡萄樣品1個(gè),對(duì)照樣品1個(gè),水分含量為75.00%。各葡萄樣品分別來(lái)自酒莊不同地塊,花期前2次、坐果和轉(zhuǎn)色期各3次施用富硒葉面肥,并于葡萄成熟期采摘;富硒葉面肥 主要成分為硒氨基酸螯合物(含有少量無(wú)機(jī)硒),安丘鑫海生物肥料有限公司;酒渣、酒泥、成品葡萄酒 來(lái)自施硒肥的美樂釀酒葡萄,其中酒渣采自酒精發(fā)酵后期,酒泥采自乳酸、蘋果酸發(fā)酵后期,成品葡萄酒窖藏兩個(gè)月,酒精度為14%。NaOH、NaBH4、HClO4、HNO3、HCOOH和鹽酸 優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;GSB 04-1751-2004硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(無(wú)機(jī)硒) 1000 μg/mL,國(guó)家有色金屬及電子材料分析檢測(cè)中心;GBW10046(GSB-24)河南小麥成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):硒含量為60±10 μg/kg 地球物理地球化學(xué)勘察研究所IGGE。

Cleanert PCX-SPE固相萃取柱(60 mg,3 mL) 天津博納艾杰爾科技有限公司;AFS-9130 雙道原子熒光光度計(jì)(配有AS-30自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)) 北京吉天儀器有限公司;EHD 36消解爐(配有φ30 mm容積75 mL磨口玻璃帶塞消解管) 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄樣品的預(yù)處理 取500 g鮮葡萄于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干48～72 h至干燥恒重,同時(shí)計(jì)算初始水分含量,然后將樣品粉碎,過(guò)40目篩,于玻璃封口樣品瓶中4 ℃冰箱保存。

1.2.2 總硒測(cè)定的樣品處理 稱取干燥的葡萄試樣0.5 g,解凍后的酒渣、酒泥試樣1.0 g,精確至0.0001 g,于消解管中,加入HNO3-HClO4體積比為4∶1的混合酸10 mL,浸泡過(guò)夜(8～12 h),于消解儀上180 ℃帶蓋(有放氣孔)消解至溶液無(wú)色(或清亮)透明,開蓋趕酸,待冒白煙后,繼續(xù)加熱至溶液約為2 mL左右,取出冷卻至室溫,往消解管中加入3 mL 6 mol/L的鹽酸,消解儀上100 ℃加熱處理20 min,取出冷卻,用純水定容至10 mL容量瓶中待測(cè)。葡萄酒樣品稱樣量為10 g,精確至0.001 g,加入混酸10 mL后,140 ℃處理2 h,升溫至180 ℃進(jìn)行消解,其他操作同上。

1.2.3 無(wú)機(jī)硒測(cè)定的樣品處理 取0.5 g烘干的葡萄樣品于50 mL離心管中,準(zhǔn)確加水20 mL,常溫下振蕩浸提1 h后,10000 r/min離心10 min,上清液經(jīng)玻璃棉過(guò)濾,用甲酸調(diào)節(jié)pH1～2后,取10 mL完全通過(guò)PCX固相萃取柱(3 mL甲醇,3 mL水活化),并收集于消解管中,按1.2.2葡萄酒的消解方法進(jìn)行消解與還原。

1.2.4 無(wú)機(jī)硒提取溶液的選擇與分離效果的驗(yàn)證

1.2.4.1 無(wú)機(jī)硒提取溶液的選擇 取0.5 g釀酒葡萄樣品添加40 μg/kg無(wú)機(jī)硒,按1.2.3的提取方法分別使用6 mol/L HCl(A)、0.1 mol/L HCl(B)、純水(C)、0.5%(V/V)NH3·H2O(D)、0.5%(V/V)NH3·H2O-1 mol/L NH4H2PO4(39+1)(E)5種溶液進(jìn)行提取,離心后,再按1.2.2葡萄酒消解方法進(jìn)行消解還原,上機(jī)檢測(cè),通過(guò)W(提取率,%)=m(檢測(cè)值)/M(實(shí)際添加值)×100,計(jì)算提取率。

1.2.4.2 無(wú)機(jī)硒分離效果驗(yàn)證 對(duì)0.5 g釀酒葡萄樣品進(jìn)行以下處理,分析熒光值變化。A.樣品全消解(同1.2.2處理);B. 經(jīng)20 mL超純水提取1 h,10000 r/min離心10 min,取10 mL用甲酸調(diào)節(jié)pH后,過(guò)已活化的PCX柱,收集于消解管中進(jìn)行消解(同1.2.3處理);C.同B提取,離心后取10 mL直接消解;D.添加40 μg/kg無(wú)機(jī)硒,同B提取,離心后取10 mL調(diào)節(jié)pH過(guò)柱消解;E. 同D添加,同B提取,離心后取10 mL直接消解;F. 添加40 μg/kg無(wú)機(jī)硒,80 μg/kg硒代氨基酸(硒代蛋氨酸與胱氨酸的混合物),同B提取,離心后取10 mL調(diào)節(jié)pH過(guò)柱消解;G.同F(xiàn)添加,同B提取,離心后取10 mL直接消解。

1.2.5 原子熒光分析

1.2.5.1 分析條件 載流溶液:5%(V/V)的鹽酸;還原溶液:含1%(M/V)NaBH4、0.5%(M/V)NaOH的溶液;載氣(Ar)流量:250 mL/min;屏蔽氣(Ar)流量:800 mL/min;燈電流:120 mA;輔陰極電流:60 mA;負(fù)高壓:300 V;原子化器高度:8 mm;進(jìn)樣體積1.0 mL。

1.2.5.2 定量檢測(cè) 對(duì)濃度為0.25、0.5、1.0、2.0和4.00 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液(儀器自動(dòng)用載流液稀釋)和樣品溶液、試劑空白溶液等上機(jī)檢測(cè),以熒光值對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)樣品溶液進(jìn)行定量。對(duì)熒光值超出校準(zhǔn)曲線范圍的試樣,將樣液用載流液稀釋后重新進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Afs-9x系列原子熒光光度計(jì)工作站軟件和Microsoft Excel 2007進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)處理和t檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品消解與還原條件的優(yōu)化

預(yù)實(shí)驗(yàn)表明,按國(guó)標(biāo)法推薦的樣品量(0.5～3 g)和HNO3-HClO4用量(9+1,10 mL),釀酒葡萄樣品不能消解完全,溶液渾濁且有較深顏色,需再補(bǔ)加混酸1～2次。茍?bào)w忠等[20]的研究顯示當(dāng)HNO3-HClO4體積比為2∶1時(shí),植物樣品的消解效果較佳,但后續(xù)趕酸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn),調(diào)整HNO3-HClO4體積比為4∶1,用量10 mL,樣品消解徹底,溶液清亮,由于HNO3的相對(duì)用量減少,待趕酸至冒白煙時(shí),恰約剩余2 mL,用時(shí)較短,較為適宜。進(jìn)一步考察了消解溫度,當(dāng)設(shè)定溫度低于170 ℃時(shí)消解速度過(guò)慢,高于190 ℃不易控制消解液體積,故本實(shí)驗(yàn)采用消解溫度為180 ℃。此外,本實(shí)驗(yàn)在消解過(guò)程中于消解管上加蓋(帶有放氣孔),混酸消解管內(nèi)的回流,減少了消解液的蒸發(fā)損失。消解完成后,加入過(guò)量的鹽酸,將六價(jià)硒還原為四價(jià)硒。

如圖1所示,還原溫度是影響測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性的重要因素,當(dāng)還原溫度小于120 ℃時(shí),測(cè)定熒光值平穩(wěn),當(dāng)溫度大于120 ℃,特別是將樣液加熱至再次冒白煙時(shí),測(cè)定熒光值降低,這可能是硒元素形成硒揮發(fā)物損失所致[20],故本實(shí)驗(yàn)選擇還原溫度100 ℃;進(jìn)一步對(duì)5～40 min還原時(shí)間進(jìn)行考察,熒光值保持平穩(wěn),結(jié)果如圖2所示,說(shuō)明還原時(shí)間5～40 min 不影響檢測(cè)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)使用還原時(shí)間為20 min。

圖1 還原溫度對(duì)硒元素?zé)晒庵档挠绊?/p>

圖2 還原時(shí)間對(duì)硒元素?zé)晒庵档挠绊?/p>

2.2 無(wú)機(jī)硒提取溶液的選擇與分離效果的驗(yàn)證

2.2.1 無(wú)機(jī)硒提取溶液的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道提取無(wú)機(jī)硒的溶劑有酸溶液[21]、水[22]和堿溶液[23];本文對(duì)5種提取溶劑的提取效果進(jìn)行比較,計(jì)算提取率,結(jié)果見圖3。提取液A、B效果較差;C、D和E的提取率均達(dá)80%以上,說(shuō)明純水和堿性溶液有更好的提取效果,再加入磷酸鹽后,提取率進(jìn)一步提高,這可能由于磷酸根離子參與樣品基質(zhì)對(duì)硒酸根、亞硒酸根離子的吸附競(jìng)爭(zhēng)所致。本研究為更有利于后續(xù)離子交換對(duì)無(wú)機(jī)硒進(jìn)行分離,選用純水做提取溶劑。

圖3 不同提取溶液提取效率的影響

2.2.2 無(wú)機(jī)硒分離效果驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),葡萄樣品的各類提取液均不能直接用于HG-AFS檢測(cè)無(wú)機(jī)硒,需要進(jìn)一步消解還原處理,這會(huì)使提取液中可能存在的硒代氨基酸等轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)硒,對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾,因此,需要進(jìn)一步凈化去除。本實(shí)驗(yàn)將提取液酸化后,流經(jīng)聚合物型強(qiáng)陽(yáng)離子交換小柱,使游離硒代氨基酸和一些弱極性化合物被吸附,而陰離子形態(tài)的無(wú)機(jī)硒則不被保留,直接收集到消解管中。

為進(jìn)一步驗(yàn)證無(wú)機(jī)硒的分離效果,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了7組處理(1.2.4.2),各組熒光值t檢驗(yàn)(p<0.01)對(duì)比情況如圖4所示。結(jié)果顯示,D、F的熒光值,與E-C的熒光值(E與C的熒光值之差),無(wú)顯著差別,而G組熒光值顯著高于D、E和F處理的熒光值(p<0.01),表明提取液中的無(wú)機(jī)硒在小柱上無(wú)保留,而硒代氨基酸被有效截留;A處理熒光值顯著高于B、C處理熒光值(p<0.01),而B、C熒光值接近試劑空白值,表明葡萄試樣中的結(jié)合態(tài)硒不能被提取,D、E、F的熒光值顯著高于B、C(p<0.01),說(shuō)明無(wú)機(jī)硒能被有效提取。

圖4 不同處理檢測(cè)熒光值的比較

2.3 方法線性關(guān)系、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度和精密度

經(jīng)對(duì)硒濃度0.25～4 μg/L系列溶液進(jìn)行驗(yàn)證,呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=187c-15.2(y為熒光值,c為溶液中硒濃度),R2=0.9989。由于空白釀酒葡萄試樣不易獲得,故選擇低硒含量的釀酒葡萄(未施硒肥)和添加了5 μg/kg無(wú)機(jī)硒的低含量釀酒葡萄,分別按總硒和無(wú)機(jī)硒的處理方法,進(jìn)行10次分析,計(jì)算熒光值標(biāo)準(zhǔn)差,按不小于3倍和10倍熒光值標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)算檢出限和定量限(總硒、無(wú)機(jī)硒基本一致),釀酒葡萄試樣(干樣)分別可達(dá)2和5 μg/kg。同樣方法,葡萄酒試樣可達(dá)0.2和0.5 μg/kg。

準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)通過(guò)測(cè)定硒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣和加標(biāo)回收試驗(yàn)完成。硒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)值符合良好,見表1,表明應(yīng)用改進(jìn)的消解還原條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。取烘干未施硒肥的葡萄樣品進(jìn)行低、中硒水平添加,施硒肥的葡萄樣品高硒水平添加,每個(gè)水平重復(fù)6次,按本實(shí)驗(yàn)確定的方法進(jìn)行消解還原后,進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)一步評(píng)價(jià)總硒測(cè)定的準(zhǔn)確性和精密度,結(jié)果亦見表1,回收率為 96.47%～97.39%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為1.76%～5.65%。說(shuō)明改進(jìn)消解還原條件后,檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度保持良好。由于酒渣、酒泥和葡萄酒都來(lái)源于葡萄,因此未對(duì)此三種基質(zhì)中的總硒加標(biāo)回收率進(jìn)行考察。

表1 釀酒葡萄中總硒測(cè)定的準(zhǔn)確性和精密度(n=6)Table 1 Accuracy and precision for determination of total selenium(n=6)

注：ND小于方法檢出限。取烘干施硒肥的葡萄樣品,進(jìn)行3水平6重復(fù)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)無(wú)機(jī)硒檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度。結(jié)果見表2,回收率為85.20%～88.91%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為5.97%～21.45%,其中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差較總硒相對(duì)較高,仍然有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。由于葡萄試樣中未檢出無(wú)機(jī)硒,本實(shí)驗(yàn)未對(duì)酒渣、酒泥和葡萄酒的無(wú)機(jī)硒檢測(cè)方法進(jìn)一步研究和方法學(xué)考察。

表2 釀酒葡萄中無(wú)機(jī)硒測(cè)定的準(zhǔn)確性和精密度(n=6)Table 2 Accuracy and precision for determination of inorganic selenium(n=6)

2.4 施用富硒葉面肥后釀酒葡萄樣品及其釀造物中硒含量的追蹤檢測(cè)

應(yīng)用本法,對(duì)釀酒葡萄試樣進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果硒肥組和對(duì)照組的釀酒葡萄均未檢出無(wú)機(jī)硒(未列出),但硒肥組和對(duì)照組的總硒含量存在極顯著差異(p<0.01),硒肥組的總硒含量為9.65～38.6 μg/kg(鮮樣),約高出對(duì)照組3倍,達(dá)到富硒食品的標(biāo)準(zhǔn)[24],說(shuō)明施用富硒葉面肥可以有效提高葡萄果實(shí)中硒含量,且為有機(jī)硒。由于硒肥中的硒主要是硒的螯合物,所以果實(shí)中的有機(jī)硒形態(tài)還有待進(jìn)一步分析。

表3 釀酒葡萄中的總硒含量(μg/kg)Table 3 Total selenium content in wine grapes(μg/kg)

對(duì)硒肥組美樂釀酒葡萄釀造后的酒渣、酒泥和葡萄酒進(jìn)行追蹤檢測(cè),總硒含量亦存在極顯著差異(p<0.01),酒渣、酒泥和葡萄酒中總硒含量和存留分?jǐn)?shù)見表4,其中硒存留分?jǐn)?shù)按75%的出酒率計(jì)算(酒渣20%,酒泥5%)?？梢娋圃形孔罡?是鮮樣硒肥組美樂釀酒葡萄平均硒含量的近6倍,其硒存留率為89.3%,說(shuō)明葡萄酒釀造過(guò)程中硒主要沉積在酒渣中,再隨酒泥沉降一部分,僅有2.0%存留在葡萄酒中。

表4 釀造產(chǎn)物中的硒含量Table 4 Selenium content in wine grapes and their brewed products

3 結(jié)論

本文以釀酒葡萄為材料,通過(guò)優(yōu)化消解還原條件和無(wú)機(jī)硒提取方法,建立了原子熒光光譜法檢測(cè)總硒和無(wú)機(jī)硒的檢測(cè)方法。方法學(xué)性能表現(xiàn)良好,在考察的濃度范圍內(nèi)(0.25～4 μg/L),R2大于0.99,總硒回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 96.47%～97.39%和1.76%～5.65%,無(wú)機(jī)硒回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為85.20%～88.91%和5.97%～21.45%,無(wú)機(jī)硒測(cè)定時(shí)能夠有效克服硒代氨基酸干擾,為富硒釀酒葡萄產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了有效檢測(cè)手段。對(duì)施用富硒葉面肥的釀酒葡萄與釀造產(chǎn)物的追蹤檢測(cè)顯示,富硒葉面肥可以有效提高葡萄果實(shí)中有機(jī)硒含量,達(dá)到富硒食品的硒含量標(biāo)準(zhǔn),但其形態(tài)還有待進(jìn)一步研究;葡萄酒的釀造過(guò)程中,硒主要隨酒渣、酒泥流失,葡萄酒中的留存率較低。