丁 源,邢家溧,,*,承 海,鄭睿行,徐曉蓉,丁超瓊,毛玲燕,沈 堅(jiān),嚴(yán)小軍,李和生,*

(1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315211;2.寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,浙江寧波 315048;3.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211)

甘氨酸甜菜堿(Glycine betaine),即N,N,N-三甲基甘氨酸,屬季銨鹽類生物堿,是甜菜堿類物質(zhì)的主要組成之一[1,2],在水生無脊椎動(dòng)物的肌肉及腺體等組織中廣泛存在,因可以呈現(xiàn)清快的甜味,可增強(qiáng)味覺的豐度和后味,是水產(chǎn)品主要的呈味物質(zhì)之一[3]。受物種[4]、生長(zhǎng)環(huán)境及食物鏈[5-6]、季節(jié)[7]等因素的綜合影響,甘氨酸甜菜堿等呈味物質(zhì)在各類水產(chǎn)品中含量也不盡相同,這也是水產(chǎn)品具有不同鮮美風(fēng)味的重要原因之一。對(duì)蟹類加工過程的研究還發(fā)現(xiàn),甘氨酸甜菜堿是水煮液滋味的主要來源之一[8],這也表明在水產(chǎn)品加工制品中,甜菜堿類物質(zhì)對(duì)于水產(chǎn)品最終風(fēng)味的形成同樣具有重要意義。

目前,食品中甘氨酸甜菜堿檢測(cè)以雷氏鹽比色法為主[9-11],該方法雖操作簡(jiǎn)單,但靈敏度較低,且易受樣品基質(zhì)組成的影響,無法滿足在不同基質(zhì)的食品中的檢測(cè)需求。比如蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品,基質(zhì)組成復(fù)雜,膽堿、氧化三甲胺等季銨鹽類化合物含量較高,對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性易造成干擾,該方法應(yīng)用于水產(chǎn)品檢測(cè)存在一定局限性[12]。而對(duì)水產(chǎn)品中該類物質(zhì)的檢測(cè)也無標(biāo)準(zhǔn)方法可供參考。本文根據(jù)甘氨酸甜菜堿親水特性,基于高效液相色譜技術(shù),優(yōu)化建立一種水產(chǎn)品甜菜堿定量檢測(cè)方法,旨在進(jìn)一步提升該類物質(zhì)在水產(chǎn)品中檢測(cè)效能,并為深入開展水產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)及新產(chǎn)品研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活花蛤、長(zhǎng)毛對(duì)蝦和梭子蟹 購于寧波市路林水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng);95%甲醇溶液(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 北京索萊寶科技有限公司。

Waters e2695高效液相色譜儀 美國(guó)沃特世公司;BEH HILIC色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.5 μm)美國(guó)沃特世公司;Milli-Q Reference超純水儀 美國(guó)MILLIPORE公司;ME204E電子天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;ST16高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取10 mg甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg),90%乙腈溶液溶解并準(zhǔn)確定容至50 mL,制成甘氨酸甜菜堿(200 μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。取適量甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,90%乙腈溶液梯度稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為15、20、30、60、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作溶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品前處理 分別取花蛤、長(zhǎng)毛對(duì)蝦、梭子蟹鮮活樣品,冰純水清洗,去殼及內(nèi)臟,取可食肌肉組織,研砵研磨后,12000 r/min超聲均質(zhì)2 min,制成樣品勻漿,-20 ℃保存。

準(zhǔn)確稱取待檢勻漿樣品0.5 g于50 mL離心管中,加入10 mL 95%甲醇溶液,渦旋震蕩30 min,4000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)雙層濾紙過濾并收集。沉淀加入10 mL 95%甲醇溶液重懸混勻,重復(fù)上述操作2次,合并濾液,并用95%甲醇溶液定容至30 mL。取5 mL濾液,氮吹濃縮至近干后,乙腈溶解并定容至2 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,濾液待上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 高效液相色譜條件 高效液相色譜柱:BEH HILIC(4.6 mm×150 mm,2.5 μm);柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:水∶乙腈(V∶V)=20∶80,等度洗脫;流動(dòng)相流速:0.7 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):195 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

將甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液按色譜優(yōu)化條件依次上機(jī)測(cè)定,記錄色譜峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),采用線性方程擬合和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)樣檢測(cè)結(jié)果及設(shè)備信噪比,考察方法檢出限和定量限。

1.4 準(zhǔn)確度及精密度實(shí)驗(yàn)

取梭子蟹均質(zhì)樣品測(cè)定目標(biāo)物本底值。以此本底值為參考,取相同樣品按照半量水平、等量水平及單倍量水平添加甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品,采用1.2.3優(yōu)化色譜條件上機(jī)檢測(cè),每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)檢測(cè)6次,分別計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

色譜結(jié)果分析采用Waters-Empower軟件,數(shù)據(jù)處理和分析采用Origin Lab Origin V 8.0分析軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)甘氨酸甜菜堿極性與親水性的特征,借鑒既往研究經(jīng)驗(yàn)[13],選用HILIC親水作用色譜柱,應(yīng)用紫外法檢測(cè)樣本中目標(biāo)物甘氨酸甜菜堿含量。親水作用色譜多以甲醇或乙腈作為流動(dòng)相。對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明以甲醇為流動(dòng)相,會(huì)造成HILIC柱保留能力下降,因此本方法中使用乙腈作為流動(dòng)相。對(duì)流動(dòng)相構(gòu)成比例進(jìn)行優(yōu)化篩選,結(jié)果表明,隨著流動(dòng)相中水相比例降低,甘氨酸甜菜堿出峰時(shí)間延遲,基線不穩(wěn)定且峰型較差,當(dāng)乙腈∶水達(dá)到90∶10時(shí),目標(biāo)物未出色譜峰(圖1),由此本方法選用的優(yōu)化流動(dòng)相組成為乙腈∶水為80∶20。

圖1 不同流動(dòng)相比例下甘氨酸甜菜堿色譜圖

2.2 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化的色譜條件下,取甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣檢測(cè),所得色譜圖如圖2所示。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3),可見在15～200 μg/mL濃度范圍兩者之間具有良好的線性關(guān)系,獲得線性方程Y=2.45×103X-2.19×102(R2=0.9999)。

圖2 甘氨酸甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 甘氨酸甜菜堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用GB/T27417-2017中信噪比評(píng)估法,對(duì)本方法檢出限進(jìn)行考察。以噪信比S/N為3計(jì),甘氨酸甜菜堿檢出限為5.12 μg/mL,以噪信比S/N為10計(jì),定量限為12.00 μg/mL。

2.3 準(zhǔn)確度及精密度分析

以梭子蟹樣品甘氨酸甜菜堿本底值為參考,制備三水平(半量、等量、加倍)加標(biāo)樣,采用本方法進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn),檢測(cè)及分析結(jié)果見表1,三水平平均加標(biāo)回收率在96.5%～97.7%之間,RSD分別為1.3%、2.2%和1.0%,符合GB/T 27404-2008的要求,表明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和可重復(fù)性。

表1 梭子蟹中甘氨酸甜菜堿回收率分析(n=6)Table 1 The recovery rate of glycine betaine in swimming crab(n=6)

2.4 水產(chǎn)品實(shí)樣檢測(cè)

采用本文所建立方法,對(duì)花蛤、對(duì)蝦、梭子蟹三種水產(chǎn)品肌肉組織匯總甘氨酸甜菜堿定量檢測(cè)。樣品色譜圖見圖4～圖6,甘氨酸甜菜堿在8.5 min左右出峰穩(wěn)定,受雜峰干擾小,保留時(shí)間RSD<0.2%。定量結(jié)果如表2所示,三類水產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～1.8%,具有較高的穩(wěn)定性。

圖4 梭子蟹樣品中甘氨酸甜菜堿色譜圖

圖5 對(duì)蝦樣品中甘氨酸甜菜堿色譜圖

圖6 花蛤樣品中甘氨酸甜菜堿色譜圖

表2 樣品中甘氨酸甜菜堿含量測(cè)定Table 2 Content of glycine betaine in

3 結(jié)論

本文建立了基于HPLC的水產(chǎn)品中甘氨酸甜菜堿檢測(cè)方法,在15～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,方法檢出限為5.12 μg/mL,定量限為12.00 μg/mL,平均回收率在96.5%～97.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.0%～2.2%。在三類水產(chǎn)品實(shí)樣測(cè)定中,梭子蟹、對(duì)蝦、花蛤所含甘氨酸甜菜堿分別為0.435、1.685和4.384 mg/g,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.5%、0.5%及1.8%。該方法操作簡(jiǎn)單,靈敏度高,線性范圍寬,可作為水產(chǎn)品中甘氨酸甜菜堿含量檢測(cè)的可靠技術(shù)手段,對(duì)進(jìn)一步研究水產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)特征及工藝技術(shù)研發(fā)具有實(shí)用價(jià)值。