張媛媛,蘇 敏,樸春紅,*,胡 洋,劉俊梅,薛艷杰,于寒松

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2.敦化市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,吉林敦化133700)

β-葡萄糖苷酶,又稱(chēng)β-葡萄糖苷水解酶(β-glucosidase,EC 3.2.1.21),它可水解末端、非還原性的烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的β-D-糖苷鍵,同時(shí)釋放葡萄糖和相應(yīng)的配基。作為纖維素酶系的重要組成部分[1],β-葡萄糖苷酶主要作用于β-1,4-葡萄糖苷鍵,也能作用于β-(1,1)、(1,2)、(1,3)、(1,6)糖苷鍵,能微弱地水解對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖和β-D-木糖苷[2],該酶存在于幾乎所有的生物體內(nèi),是生物體糖代謝途徑中不可或缺的一類(lèi)酶。不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子量、結(jié)構(gòu)和組成差異很大。已有研究報(bào)道,不同微生物所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶的相對(duì)分子量從幾十到幾百kDa[1],在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(Carbohydrate-active enzymes database,CAZy)中,基于氨基酸序列的同源性和結(jié)構(gòu)的相似性,將已知的β-葡萄糖苷酶分為7個(gè)家族:GH1、GH2、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116[3-5],不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶所屬的家族也不同,細(xì)菌、植物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶屬于GH1家族,許多真菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶屬于GH3家族。

隨著國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)β-葡萄糖苷酶的深入研究發(fā)現(xiàn),微生物發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶具有活性高、底物特異性強(qiáng)等特點(diǎn),如青霉[6]、黑曲霉[7-9]等。同時(shí),微生物發(fā)酵獲得的β-葡萄糖苷酶容易獲得高純度的酶制劑。因此近幾年微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。本文主要闡述生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物的主要來(lái)源和特性及其在食品加工中的應(yīng)用進(jìn)展,分析和指出目前存在問(wèn)題和解決途徑。

1 β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)菌株

微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶其數(shù)量龐大,價(jià)格低廉,制備容易而且用途廣泛。迄今為止,大規(guī)模生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶多數(shù)來(lái)源于自然界的微生物,主要集中在霉菌、酵母菌和細(xì)菌等。霉菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶研究較早,也比較充分。近幾年陸續(xù)有關(guān)于酵母菌如馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、細(xì)菌如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的相關(guān)研究。

1.1 霉菌來(lái)源

霉菌一直是產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的一個(gè)重要來(lái)源,在工業(yè)中廣泛應(yīng)用。包括黑曲霉、米曲霉、綠色木霉、青霉菌等。表1列舉了部分霉菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。從表1可以發(fā)現(xiàn),大部分霉菌β-葡萄糖苷酶的最適溫度在40～60 ℃之間,最適pH大部分為酸性,一般在4.5～6.0之間,也有部分菌株所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶偏堿性。如毛霉菌(MucormieheiYH-10)[10]和米曲霉(Aspergillusoryzae)[11]分泌的β-葡萄糖苷酶的最適pH都達(dá)到8.0。近年來(lái),耐熱的β-葡萄糖苷酶越來(lái)越受歡迎。彭利沙等[12]從綠色木霉(TrichodermavirideGIM3.139)中分離的β-葡萄糖苷酶最適溫度為80 ℃,隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),在70～80 ℃條件下酶活可維持在90%,在80～95 ℃反應(yīng)一段時(shí)間后,酶活雖有下降趨勢(shì),但相對(duì)酶活仍維持在50%,具有較好的耐熱性;一些霉菌分離出的β-葡萄糖苷酶在寬范圍的溫度和pH下都有較好的穩(wěn)定性。Abdella等[13]研究發(fā)現(xiàn)從耐高溫黑曲霉(AspergillusnigerNRRL3122)所分離出的β-葡萄糖苷酶最適pH為3.98,低于其他霉菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶,在pH為3時(shí),其相對(duì)酶活仍能保持在70%以上。白葡萄酒釀造中,常常添加外源糖苷酶促進(jìn)香氣濃郁的萜烯化合物的釋放[14],但是葡萄醪pH一般為3.0～3.5,因此耐酸性β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄醪中糖苷態(tài)的香氣前體物質(zhì)的轉(zhuǎn)化具有重要的作用。Zhou等[15]從一種來(lái)源黑曲霉(AspergillusnigerSK34.002)的β-葡萄糖苷酶在55 ℃下孵育12 h后仍保持74%的酶活性,而且在4 ℃下儲(chǔ)存7個(gè)月后,它的酶活性幾乎保持不變,其顯著的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性在水解工業(yè)生產(chǎn)中非常有利。

表1 部分霉菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶水解底物的類(lèi)型也不同,如對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、水楊苷、纖維二糖等。Xie等[7]從黑曲霉(AspergillusnigerNo.5.1)分離出的β-葡萄糖苷酶水解p-NPG和纖維二糖比水解對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷、纖維三糖、纖維四糖、纖維五糖和七葉苷更有效,但不能水解結(jié)晶纖維素。常軍等[9]從黑曲霉(Aspergillusniger)分離的β-葡萄苷酶對(duì)纖維二糖的親和性最大,對(duì)麥芽糖、昆布糖幾乎沒(méi)有水解作用,說(shuō)明該酶可水解β-1,4-糖苷鍵,但基本上不水解α-1,4-糖苷鍵和β-1,3-糖苷鍵。Guo等[16]從根毛霉(RhizomucormieheiCAU432)分離的β-葡萄糖苷酶在芳基糖苷中對(duì)p-NPG水解性最高,在低聚糖中對(duì)昆布二糖水解性更高,可催化各種寡糖中β-1,2、β-1,3、β-1,4和β-1,6鍵的裂解,尤其是β-1,3-糖苷鍵并具有較高的轉(zhuǎn)糖基活性,在一定條件下可將葡萄糖和纖維二糖合成龍膽二糖。Gao等[17]從青霉菌(Pencilliumpiceum)分離的β-葡萄糖苷酶對(duì)水楊苷的水解性更高,并且也能水解木糖,是一種具有β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶活性的新型雙功能糖苷水解酶。每種酶的獨(dú)特性質(zhì)為食品藥品行業(yè)特定需求提供更多的選擇性。

1.2 酵母菌和乳酸菌來(lái)源

發(fā)酵在食品工業(yè)中占有非常重要的地位,特別是酵母菌和乳酸菌發(fā)酵。很多食品原料中,大部分芳香物質(zhì)以糖苷前體形式存在,發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以將它們釋放為游離的芳香物質(zhì),提高產(chǎn)品的感官特性和質(zhì)量。另一方面,部分霉菌會(huì)產(chǎn)生對(duì)人身體有害的毒素[21],不能直接加入到食品中。因此,擴(kuò)大β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)種類(lèi)也顯得越發(fā)重要。表2列舉了部分酵母菌和乳酸菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。

表2 部分酵母菌和乳酸菌來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

釀酒酵母一直以來(lái)是葡萄酒發(fā)酵的主要微生物,但是越來(lái)越多的研究表明,非釀酒酵母如長(zhǎng)飽洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)在葡萄汁酒精發(fā)酵中發(fā)揮重要作用,發(fā)酵過(guò)程中貢獻(xiàn)更多的芳香類(lèi)化合物[22-23],使葡萄酒具有更加復(fù)雜的口感和香氣,與其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶有關(guān)。已有研究證明馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是耐熱β-葡萄糖苷酶的有效生產(chǎn)者[24]。K.marxianus菌株常見(jiàn)于各種奶制品,如kefir粒、軟奶酪、奶酪等,已經(jīng)被分離和鑒定[25-26]。K.marxianus顯示了一些獨(dú)特的性質(zhì),由于其在各種底物和環(huán)境中的耐高溫能力[27]、生長(zhǎng)速率快和富含豐富的酶系統(tǒng)的特點(diǎn),如脂肪酶[28]、蛋白酶[29]、葡聚糖酶[30]、β-葡萄糖苷酶[31]等,是工業(yè)過(guò)程中理想的微生物原料。不同的來(lái)源的K.marxianus,如釀酒酵母和乳酸克魯維酵母[27]是食品安全級(jí)的,并且在歐洲已經(jīng)被列入食品安全生物制劑的權(quán)威名單中,可以添加到食品和飼料中[32]。目前,研究表明K.marxianus可以作為益生菌,其效果在臨床研究已經(jīng)得到認(rèn)可[33-35],并且發(fā)現(xiàn)該菌株具有高β-葡萄糖苷酶的活性[36]。除此之外,食品安全級(jí)的乳酸菌也可以分泌出獨(dú)特的β-葡萄糖苷酶。Ko等[37]從朝鮮泡菜乳酸菌(LactobacilluskimchiJB301)發(fā)酵液中分離出的β-葡萄糖苷酶,可以將虎杖中提取的白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇,產(chǎn)率高達(dá)99%,與其他來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)成本高和發(fā)酵過(guò)程中可能產(chǎn)生的毒性[38-39]弊端相比,LactobacilluskimchiJB301來(lái)源的β-葡萄糖苷酶具有高食品安全性特點(diǎn),在功能性食品中有較高潛在應(yīng)用價(jià)值。

1.3 其它微生物來(lái)源

除了上述來(lái)源的β-葡萄糖苷酶外,還有一些其他來(lái)源的β-葡萄糖苷酶具有其獨(dú)特的性質(zhì),表3列舉了其他微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶酶學(xué)特性。

表3 其他來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)

Hernandez-Guzman等[48]從申克孢子絲菌(SporothrixschenckiiEH-206)發(fā)酵液分離的β-葡萄糖苷酶,為由兩個(gè)相同亞基構(gòu)成的二聚體,每個(gè)亞基的分子量96.8 kDa,其分子量在197 kDa左右,主要水解纖維二糖、昆布糖、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷和對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。Asic等[49]所研究的雙孢蘑菇菌(Agaricusbisporus)分泌的β-葡萄糖苷酶催化反應(yīng)迅速,最大反應(yīng)速率為833 U/mg,是由兩個(gè)分子量大約為46和62 kDa亞基構(gòu)成的二聚體。變形桿菌(ProteusmirabilisVIT117)[50]分離的β-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐堿能力,其最適pH為9.0,而從嗜熱微生物中分離出來(lái)的β-葡萄糖苷酶顯示出極強(qiáng)的耐熱能力,如Mallek-Fakhfakh等[51]發(fā)現(xiàn)的嗜熱真菌(TalaromycesthermopHilus)分泌的β-葡萄糖苷酶在50 ℃下可以穩(wěn)定34 h,Kong等[52]從嗜熱細(xì)菌(ThermotoganapHthopHilaRUK-10)發(fā)酵液分離出的重組β-葡萄糖苷酶最適溫度為95 ℃,在75、80、85和90 ℃下的半衰期是分別為84、32、14和3 h。

2 β-葡萄糖苷酶在食品中的應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶可以廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)、保健品、生物能源、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[56],特別是食品工業(yè)和保健品領(lǐng)域。果汁、果酒和茶葉中存在多種風(fēng)味物質(zhì)且極易揮發(fā),但自身又存在沒(méi)有香味且不易揮發(fā)的風(fēng)味前體物質(zhì),在β-葡萄糖苷酶作用下裂解糖苷鍵,產(chǎn)生具有濃郁香氣的芳香物質(zhì)。因此,在食品工業(yè)中β-葡萄糖苷酶可以起到增香的作用。在保健品行業(yè)中,β-葡萄糖苷酶可將異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為較高活性的異黃酮苷元,也可以使白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.1 果汁中應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶用作食品添加劑[57]作用于水果中的芳香前體物質(zhì),利于果汁脫苦和果汁增香。高倩[58]對(duì)廉江紅橙果汁添加外源β-葡萄糖苷酶,增加了紅橙果汁中3-蒈烯、安息香醛、環(huán)己醇等風(fēng)味成分,改善了紅橙果汁的風(fēng)味,起到了增香的作用。王鵬等[59]對(duì)蟠桃汁進(jìn)行β-葡萄糖苷酶酶解處理,蟠桃汁的桃果香、花清香、香甜味顯著增加,不良風(fēng)味屬性(異味和蒸煮味)顯著降低。張瑤等[60]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)新鮮檸檬汁和β-葡萄糖苷酶酶解處理的檸檬汁的香氣成分進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)酶解后檸檬汁的香氣種類(lèi)增加且酶解汁中香氣成分總量增加了11%,不僅釋放出新的香氣物質(zhì),還對(duì)加工過(guò)程中損失的香氣起到彌補(bǔ)作用。此外,β-葡萄糖苷酶也可用于果汁脫苦,可以有效地降低胡柚汁中檸檬苦素、柚皮苷等苦味物質(zhì),幾乎不影響果汁中VC等營(yíng)養(yǎng)成分[61]。

2.2 葡萄酒中應(yīng)用

在葡萄酒的生產(chǎn)中,β-葡萄糖苷酶能夠顯著增加葡萄酒中的糖苷萜烯類(lèi)前體物質(zhì)的水解和單萜類(lèi)物質(zhì)的釋放,在葡萄酒香氣形成過(guò)程中起著重要作用[62]。Hu等[63]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自H.uvarum菌株的β-葡萄糖苷酶顯示出對(duì)C13-異構(gòu)體和一些萜類(lèi)的芳香糖苷的催化特異性,在葡萄酒釀造中增強(qiáng)了葡萄酒中鮮花、甜味、漿果和堅(jiān)果的香氣特征。另外,添加β-葡萄糖苷酶的葡萄酒不僅使會(huì)單萜、酚類(lèi)和降異戊二烯的濃度顯著增加,且葡萄酒本身的成色物質(zhì)幾乎不會(huì)受到損失[64-65]。Hu等[66]研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自微生物的一種新的β-葡萄糖苷酶顯示出對(duì)苯基化合物和C13-異構(gòu)體的糖苷的水解特異性,并且對(duì)釀酒條件表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐受性,進(jìn)一步改善葡萄酒的花香和水果香味特征。

2.3 其他

β-葡萄糖苷酶還可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化大豆異黃酮提高保健功能方面[67]。Baú等[68]優(yōu)化豆?jié){加工中β-葡萄糖苷異黃酮向糖苷配基的轉(zhuǎn)化研究,在豆?jié){加熱中維持大豆黃素和染料木黃酮苷元含量,黃豆黃素和β-葡萄糖苷含量增加,丙二酰葡萄糖苷含量降低。Abdella等[13]將黑曲霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶水解大豆粉異黃酮糖苷,用Box-Behnken優(yōu)化反應(yīng)影響因素,確定染料木黃酮生產(chǎn)的有效變量,染料木素的濃度增加了11.73倍,發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化使抗氧化活性增加了四倍。Pyo等[46]將β-葡萄糖苷酶添加到豆奶中,能夠?qū)⑤^低的異黃酮糖苷物質(zhì)有效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷元,其中苷元(大豆黃素+染料木黃酮)平均增加7.1倍。

近幾年,β-葡萄糖苷酶在高生理活性的單體的生產(chǎn)方面應(yīng)用備受關(guān)注,如白藜蘆醇和人參稀有皂苷。β-葡萄糖苷酶可以將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇,目的產(chǎn)物得率高,具有較可觀的工業(yè)化應(yīng)用前景。Gaensly等[69]篩選了308個(gè)本地酵母菌株,其中Hanseniasporauvarum生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵過(guò)程中顯示出有效轉(zhuǎn)化白藜蘆醇葡萄糖苷的能力。馮薇等[70]對(duì)虎杖復(fù)合酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和虎杖苷專(zhuān)用酶進(jìn)行白藜蘆醇苷酶解制備白藜蘆醇的工藝,發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)化效果最好。Zhou等[15]將虎杖通過(guò)β-葡萄糖苷酶的酶促切割而產(chǎn)生白藜蘆醇,幾乎所有虎杖中的白藜蘆醇苷都轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。

β-葡萄糖苷酶可以有效的水解人參皂苷,將大量的常見(jiàn)皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷,是大量獲得稀有人參皂苷的新途徑[71]。Siddiqi等[47]利用β-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)移葡萄糖基的作用,可以將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg3。邵巍等[55]研究利用β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rb1的C-21位兩個(gè)-GLc鍵水解,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3。

3 展望

微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶資源的挖掘和酶學(xué)特性的分析已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展,特別是在食品微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶的特性和應(yīng)用,越來(lái)越受到食品加工領(lǐng)域的關(guān)注,但仍存在一些問(wèn)題亟待解決。第一:雖然關(guān)于微生物β-葡萄糖苷酶研究報(bào)道較多,但實(shí)際市售的β-葡萄糖苷酶的提取來(lái)源大多還是來(lái)源于杏仁,由于原料有限,其價(jià)格相對(duì)較高,要應(yīng)用于大規(guī)模的食品工業(yè),就單從成本考慮限制其應(yīng)用。這說(shuō)明微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶雖然有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值,但是由于其產(chǎn)酶量少,活性低,大大限制了研究成果的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步結(jié)合基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù),挖掘高活性β-葡萄糖苷酶微生物和優(yōu)化價(jià)格低廉的生產(chǎn)工藝將是亟待解決的問(wèn)題。第二:與其他來(lái)源的酶相比,β-葡萄糖苷酶底物特異性較廣泛,而在大多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)其最適底物基本為p-NPG,對(duì)其他類(lèi)型的β-葡萄糖苷鍵的底物親和性相對(duì)較低,而p-NPG不是食品成分。因此,尋找對(duì)自然底物更強(qiáng)特異性的β-葡萄糖苷酶,挖掘潛在的生物學(xué)功能是目前的重要挑戰(zhàn)。第三:β-葡萄糖苷酶在食品風(fēng)味改良方面的研究已經(jīng)普遍得到認(rèn)可,但是目前應(yīng)用領(lǐng)域多限制在葡萄酒和茶葉的增香方面。與人工添加的芳香物質(zhì)相比,酶解產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)更具有安全性,能滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)食品原汁原味的需求。拓寬β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒋龠M(jìn)β-葡萄糖苷酶的創(chuàng)新和研究發(fā)展,在食品工業(yè)中極具應(yīng)用價(jià)值,為食品工業(yè)帶來(lái)新的發(fā)展契機(jī)。