黃曉梅 ，蘇秋權(quán) ，李亞菲 ，王威利 ，殷秋妙 ，伍健光 ，吳維煇

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品公共監(jiān)測中心，廣東 廣州 510640；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（廣州），廣東 廣州 510640；3.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520）

【研究意義】雞蛋的營養(yǎng)主要來源于蛋清與蛋黃，二者的營養(yǎng)價值不同，其相關(guān)制品受到不同人群的青睞。例如，蛋清富含蛋白質(zhì)，是普通人群補(bǔ)充蛋白的重要來源，也是烘焙制品的重要原料；蛋黃是蛋撻、餅干、蛋黃派等產(chǎn)品的理想原料。蛋雞在養(yǎng)殖過程中難免會使用一些獸藥來治療相關(guān)疾病，雞蛋是蛋雞排出獸藥的重要途徑，因此，雞蛋中的獸藥殘留備受關(guān)注。然而，由于蛋清與蛋黃的形成機(jī)制不同，可能會導(dǎo)致獸藥在蛋清與蛋黃中的獸藥殘留水平不同。由于蛋清與蛋黃的基質(zhì)不同，其樣品的分析方法存在差異性。例如，在分析磺胺類藥物殘留時，蛋黃樣品經(jīng)提取后需經(jīng)除脂步驟［1］?；前范谆奏け粡V泛應(yīng)用于預(yù)防和治療畜禽類的抗菌和抗球蟲病。但使用磺胺二甲嘧啶后，其在雞蛋中的殘留量很高［2］，因此該藥物說明書明確規(guī)定蛋雞產(chǎn)蛋期禁用。但在生產(chǎn)實踐中，磺胺二甲基嘧啶仍非法用于蛋雞，從而導(dǎo)致雞蛋中藥物殘留時有發(fā)生［3］。本研究以磺胺二甲基嘧啶為例，探討蛋液（蛋清與蛋黃的混合液）、蛋清、蛋黃中獸藥殘留分析方法。

【前人研究進(jìn)展】早期畜禽樣品中磺胺二甲基嘧啶的提取和凈化方法較為復(fù)雜。安勝英等［4］采用C18填料與雞蛋樣品研磨，將其裝填至含有無水硫酸鈉的小柱，先用正己烷洗脫，除去脂肪等非極性化合物，再用二氯甲烷洗脫目標(biāo)化合物。近年來，固相萃取法是畜禽樣品中磺胺二甲基嘧啶的常用凈化方法。李宏娟等［5］采用乙酸乙酯提取和0.1 mol/L鹽酸溶劑轉(zhuǎn)換，再用正己烷除脂，然后用MCX柱凈化；ZHAO等［6］采用固相萃取柱（填料為多層碳納米管）對豬肉、雞肉和雞蛋樣品中磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行凈化處理；HOU等［7］采用類似方法處理豬肉樣品。雖然固相萃取法能極大程度地降低樣品中基質(zhì)干擾效應(yīng)，但是該方法較為耗時。以上方法均不適用于大批量樣品的快速檢測。盡管有文獻(xiàn)采用C18分散劑快速實現(xiàn)水產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的凈化［8］，以及采用QuEChERS快速實現(xiàn)牛奶中磺胺二甲基嘧啶的凈化［9］，但二者的耗材相對較為昂貴；也有文獻(xiàn)報道了酶聯(lián)免疫法快速檢測肉和蛋中磺胺二甲基嘧啶的方法［3,10］，但是酶聯(lián)免疫法可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果而只適用于初步篩查［11-12］?！颈狙芯壳腥朦c】液相色譜-紫外/熒光法是畜禽產(chǎn)品中磺胺二甲基嘧啶的常用檢測方法，但是檢測限較高［13-15］，不適用于雞蛋中磺胺二甲基嘧啶（禁用藥物）的分析；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的靈敏度相對較高［16-17］，可以用于禁用藥物的分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用液液萃取建立蛋液、蛋黃和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的快速前處理方法；同時利用高靈敏度和高選擇性的高效液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCESI-MS/MS）對樣品中磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行檢測，以期建立一種磺胺二甲基嘧啶的快速、綠色經(jīng)濟(jì)、靈敏的檢測方法，為大批量雞蛋中禁用藥物——磺胺二甲基嘧啶的檢測提供一種可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甲醇（色譜純，德國默克公司），乙腈和正己烷（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；尼龍66濾膜（天津津騰公司），塑料離心管（美國Corning CentriStar公司），渦旋儀（美國Labnet公司），5804R臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（8040 HPLC-MS/MS，日本島津公司），ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色譜柱（100×2.1 mm id，英國ACE公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與制備 雞蛋樣品于2017年7月采自廣州市不同的農(nóng)貿(mào)市場和超市，同時記錄樣品的產(chǎn)地、供貨商等信息。對雞蛋分離出蛋黃和蛋清；蛋液、蛋黃、蛋清樣品均采用勻漿機(jī)勻漿后置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品前處理 蛋液、蛋黃、蛋清樣品恢復(fù)至室溫后，稱取1.0 g置于50 mL塑料離心管。加入500 μL水稀釋樣品；加入8 mL乙腈，渦旋30 s，超聲10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液于15 mL塑料離心管。上清液水浴（40 ℃）中氮吹至0.5 mL，加入乙腈-0.1%甲酸水溶液（1∶9，V/V）至2 mL，渦旋30 s，10 000 r/min離心10 min。蛋清樣品，取1 mL上清液過濾膜，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測磺胺二甲基嘧啶的濃度；蛋黃和蛋液樣品，取1.5 mL上清液于2.0 mL塑料離心管，加入正己烷（300 μL），渦旋30s，10 000 r/min離心5 min，取下層水相過濾膜，經(jīng)HPLC-MS/MS檢測磺胺二甲基嘧啶的濃度。

1.2.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的制備 取空白的蛋液、蛋黃、蛋清樣品，按照1.2.2步驟操作，得到空白基質(zhì)溶液。取空白蛋液、蛋黃、蛋清基質(zhì)溶液適量，加入適量磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，采用逐漸稀釋法分別配制蛋液、蛋黃和蛋清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL），以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為橫坐標(biāo)、濃度水平為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 儀器分析 基于本課題組建立的HPLC-MS/MS測定氟喹諾酮類藥物方法［18］，建立HPLCMS/MS測定磺胺二甲基嘧啶方法。ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色譜柱（100×2.1 mm id，英國ACE公司），柱溫40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流動相組成為0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），流速為0.3 mL/min，流動相梯度如表1所示。質(zhì)譜分析采用正離子電噴霧離子源（ESI）和多重離子裂解監(jiān)測模式（MRM），離子化電壓為4 500 V，去溶劑化和加熱板溫度分別為250 ℃和400 ℃，霧化氣和干燥氣流量分別為3 mL/min和15 mL/min。磺胺二甲基嘧啶的定性和定量離子對分別為m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05。

1.2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度考察 在空白蛋液、蛋黃和蛋清中分別添加低、中、高3個不同濃度的磺胺二甲基嘧啶進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，各濃度3個平行實驗，3次重復(fù)，求平均回收率及批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表1 磺胺二甲基嘧啶色譜分離的流動相梯度Table 1 Gradient mobile phases for the chromatographic separation of sulfamethazine

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

蛋液、蛋清、蛋黃中磺胺二甲基嘧啶的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；前范谆奏ぴ谙鄳?yīng)濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)平方值R2＞999。根據(jù)待測物信噪比（S/N）≥3為方法檢測限，S/N≥10為方法定量限的原則，測得磺胺二甲基嘧啶在蛋液、蛋黃和蛋液中的方法檢測限為0.5 ng/g，方法定量限為1.0 ng/g。

2.2 回收率與重現(xiàn)性

本研究采用蛋液、蛋黃和蛋清進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)回收試驗，表2列出了磺胺二甲基嘧啶在3種基質(zhì)中不同添加水平的平均回收率。蛋液、蛋黃和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的平均回收率分別為 78.4%～85.2%、77.9%～89.0%、83.0%～88.1%，批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.7%～5.9%、2.8%～5.3%、2.9%～11.5%，批間變異系數(shù)分別為4.0%～9.7%、4.8%～9.2%、5.4%～13.8%，表明本研究建立的分析方法穩(wěn)定可靠。

將本方法與文獻(xiàn)報道的生物樣品中磺胺二甲基嘧啶分析方法進(jìn)行比較（表3）可知，本方法具有良好的加標(biāo)回收率和較低的方法檢測限，能滿足實際樣品測定的要求。

2.3 實際樣品分析

將本研究方法應(yīng)用于廣州市15例雞蛋樣品中磺胺二甲基嘧啶的分析，僅1例雞蛋樣品檢測到磺胺二甲基嘧啶，蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的含量分別為0.66、0.94、0.47 ng/g。圖2是蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色譜圖。

3 討論

圖1 磺胺二甲基嘧啶的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合結(jié)果Fig.1 Matrix matching standard curve fitting of sulfamethazine

圖2 蛋液、蛋黃、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of sulfamethazine in whole eggs, yolks, and albumens

3.1 提取方法的優(yōu)化

雞蛋樣品，尤其是蛋清樣品，蛋白質(zhì)含量相對較高，在提取時直接加入提取劑（乙腈）后，樣品迅速結(jié)塊，易包裹目標(biāo)化合物，致使回收率降低且重復(fù)性不好。為了解決該問題，本研究在加入提取劑之前，加入0.5 mL水稀釋樣品，且在輕微震蕩狀態(tài)下加入提取劑，然后馬上渦旋，能有效避免樣品結(jié)塊的現(xiàn)象。本研究考察了提取溶劑的體積和提取次數(shù)對提取效率的影響。結(jié)果顯示，8 mL提取體積與10 mL提取體積的回收率（85%～89% vs 86%～89%）相當(dāng)，均高于5 mL提取體積（71%～73%）；相同提取體積條件下，一次提取與二次提取的回收率類似，但是二次提取時在后期正己烷除脂時存在乳化現(xiàn)象。因此，本研究將提取劑的體積設(shè)定為8 mL，提取次數(shù)設(shè)定為1次。

表2 蛋液、蛋黃、蛋清中添加不同濃度磺胺二甲基嘧啶的回收率Table 2 Recoveries of sulfamethazine with various addition concentrations in whole eggs, yolks, and albumens

表3 本研究方法與已報道的磺胺二甲基嘧啶分析方法的檢測限與加標(biāo)回收率比較Table 3 Comparison of detection limit and recovery between this method and the reported sulfamethazine detection method

3.2 凈化方法的優(yōu)化

大多數(shù)研究采用固相萃取小柱來凈化樣品［5-7］，較為耗時，不適合大批量樣品的分析。本研究根據(jù)磺胺二甲基嘧啶難溶于非極性溶劑正己烷，利用正己烷除去蛋液和蛋黃中脂肪等非極性雜質(zhì)。凈化方法較為簡潔，適合大批量樣品的分析。蛋清的脂肪含量極低，不需要凈化，可直接進(jìn)行儀器分析。

3.3 儀器方法的建立

雞蛋中磺胺二甲基嘧啶的含量采用HPLCMS/MS檢測。首先對磺胺二甲基嘧啶化合物進(jìn)行全掃描（Full scan, m/z 50～500），確定目標(biāo)化合物的特征離子；然后將特征離子作為母離子，進(jìn)行子離子掃描，確定該目標(biāo)化合物的定性和定量離子對；最后，通過MRM模式，對化合物的碰撞能等參數(shù)逐一優(yōu)化，使其達(dá)到最優(yōu)。最終確定磺胺二甲基嘧啶的定性和定量離子對分別為m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05，碰撞能分別為-16 V和-30 V。

4 結(jié)論

蛋黃與蛋清的基質(zhì)不同，導(dǎo)致二者的前處理方法存在差異性。蛋黃的脂肪含量相對較高，需要采取除脂步驟；而蛋清的蛋白質(zhì)含量相對較高，在提取過程中需加水稀釋以防止蛋白質(zhì)結(jié)塊包裹目標(biāo)化合物。本研究采用乙腈溶劑提取、正己烷溶劑除脂的手段，建立雞蛋的蛋液、蛋黃和蛋清樣品的快速前處理方法，同時采用靈敏度高和選擇性好的HPLC-MS/MS分析樣品中磺胺二甲基嘧啶的含量。本研究的樣品前處理方法不需要過柱，操作簡潔、耗材低廉、方法靈敏度高，且方法具有良好的加標(biāo)回收率和較好的重現(xiàn)性，適合大批量蛋液、蛋黃與蛋清樣品中磺胺二甲基嘧啶的快速檢測。