焦繼超 馬玉德 李小亮 付愛軍 孫林林

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是臨床常見的一種嚴重的急性腦血管疾病，指腦表面或腦組織內(nèi)血管破裂，血液及其成分流入蛛網(wǎng)膜下腔，多發(fā)生于顱內(nèi)動脈瘤、外傷、藥物或其他原因[1-2]。SAH后的早期腦損傷影響著患者預(yù)后和神經(jīng)功能變化。最近研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細胞自噬可能發(fā)生于早期腦損傷且起到一定的改善作用[3-4]。自噬是自身對受損的細胞蛋白和細胞器進行降解的過程，適度的自噬對維持細胞內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定和細胞再生起著重要作用。自噬的表達相關(guān)蛋白Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ (microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3-Ⅱ)經(jīng)常被標(biāo)記自噬的水平，3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)常作為自噬研究的特異性抑制劑。尼莫地平是一種二羥吡啶類鈣離子通道阻滯劑，是臨床常見的一種對SAH有治療作用的藥物，可改變細胞通透性，影響神經(jīng)細胞凋亡等病理生理改變[5]，然而，SAH中尼莫地平對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞自噬影響的報道較少。本研究通過頸內(nèi)動脈刺破法制備SAH模型，探討尼莫地平對SAH大鼠海馬CA1區(qū)自噬的影響，為SAH的臨床救治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

成年雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠48只，體質(zhì)量：360±5 g，購于解放軍軍事醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所的動物實驗研究中心[動物合格證號：SCXK-(軍)2014-0001]。飼養(yǎng)條件：溫濕度適宜，自由攝食飲水。對大鼠編碼后按隨機數(shù)字表法分為Sham組、SAH組、SAH+尼莫地平組(NMDP組)、SAH+尼莫地平+3-MA(3-MA組)，每組各12只。本研究方案經(jīng)本院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器

尼莫地平注射液：德國Bayer Pharma AG 。免疫組化二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。3-MA：美國Sigma公司。蘇木素-伊紅(HE)：南京榮春生物科技有限公司。大鼠抓力測定儀器：北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司。RM2245半自動輪轉(zhuǎn)式切片機、手術(shù)顯微鏡：德國LEICA公司。DYY-7C型電泳儀電源、電轉(zhuǎn)儀電源：北京市六一儀器廠。凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad 公司。

1.3 SAH模型制作

采用頸內(nèi)動脈刺破法[6-7]制備SAH模型。大鼠稱體質(zhì)量，10%水合氯醛 (4.0 ml/kg)腹腔注射麻醉，大鼠于鼠板仰臥位固定，頸前區(qū)備皮，頸前區(qū)縱行切口，分離頸總、頸內(nèi)、頸外動脈和枕動脈等血管，分離結(jié)扎枕動脈并離斷，分離結(jié)扎頸外動脈并離斷，牽拉離斷的頸外動脈近心端使其與頸內(nèi)動脈呈一條直線，纖芯從頸外動脈刺入，進入約18 mm后感阻力，此為頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段(取材時可看到刺破口)，刺破血管，停留15 s后拔出線栓并結(jié)扎頸外動脈，逐層縫合，消毒并無菌輔料包扎。保溫復(fù)蘇后送動物飼養(yǎng)房繼續(xù)飼養(yǎng)。造模成功的衡量標(biāo)準：(1)血管刺破感明顯；(2)血管刺破后短暫的瞳孔散大；(3)剝離腦組織時肉眼可見明顯的血液散布在腦底、環(huán)池等部位。

Sham組：只進行血管分離并不刺破血管。NMDP組：造模成功后30 min 腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)。3-MA組：于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，且造模成功后30 min腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)。Sham組與SAH組給予腹腔注射等量等滲鹽水。模型制作過程中無大鼠死亡。

1.4 穿梭箱試驗

ZH-CSC系統(tǒng)(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)記錄并分析動物的動物行為學(xué)能力，隨機選取各組大鼠6只于干預(yù)后24 h放置于穿梭箱中，先給予5 s聲光刺激培養(yǎng)條件反射，隨后給予20 s交流電刺激，間隔10 s后進入下一輪訓(xùn)練。訓(xùn)練中大鼠逃離危險區(qū)至安全區(qū)的次數(shù)記錄為躲避反應(yīng)次數(shù)；大鼠逃離危險區(qū)至安全區(qū)的時間記錄為躲避反應(yīng)時間。躲避反應(yīng)次數(shù)越多，躲避反應(yīng)時間越少表明動物學(xué)習(xí)能力越強。

1.5 HE染色

在大鼠穿梭箱實驗后，每只大鼠給予10%水合氯醛4.0 ml/kg麻醉，麻醉成功后仰臥位固定，剪開胸廓，經(jīng)左心室依次給予0.9%等滲鹽水500 ml及4%多聚甲醛200 ml灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛浸泡固定，切取帶有海馬CA1區(qū)腦組織，常規(guī)進行石蠟包埋，以5 μm厚度冠狀位切片。進行脫蠟、水化、HE染色、封片等實驗步驟。400倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞，隨機選取6個視野拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件 (美國，Media Cybernetics公司)分析圖片，記錄正常形態(tài)神經(jīng)細胞并計算均值。

1.6 免疫組化

石蠟切片的制作過程同HE染色。各組隨機選取6張大鼠石蠟切片進行免疫組化染色：常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鈉溶液修復(fù)80 s，過氧化氫去離子水室溫孵育8 min，滴加兔抗體(LC3 1∶100，Beclin-1 1∶100)，置濕盒4 ℃過夜，磷酸鹽緩沖溶液沖洗，滴加組化羊抗兔二抗，恒溫箱孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，脫水透明，中性樹膠封片，400倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞并采集視野。Image-Pro Plus 6.0分析圖片，記錄陽性神經(jīng)細胞并計算均值，結(jié)果半定量分析。

1.7 Western blotting實驗

每組剩余6只大鼠給予10%水合氯醛4.0 ml/kg麻醉，斷頭取腦，在冰上用神經(jīng)剝離子剝離出海馬，沿海馬遠端1/3切取海馬CA1區(qū)腦組織，放置于EP管中剪碎，加入RIPA裂解緩沖液，加入苯甲基磺酰氟及磷酸酶抑制劑，勻漿，離心(12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃，2 min)，提取海馬CA1區(qū)組織蛋白，牛血清白蛋白為標(biāo)準測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF) 轉(zhuǎn)膜，于PVDF上滴加Beclin-1一抗(1∶1 000)、LC3-Ⅱ一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜，TBST緩沖液(含Tris-Hcl、NaCl、Tween20)洗膜3次，每次15 min，羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，滴加電化學(xué)發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光顯影保存條帶，Image J 軟件分析目的條帶灰度值。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和LC3-Ⅰ為內(nèi)參對照。陽性條帶與內(nèi)參的灰度值比值為相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 穿梭箱實驗

與Sham組比較，SAH組大鼠學(xué)習(xí)能力較差，躲避反應(yīng)次數(shù)減少，躲避反應(yīng)時間增多(均P<0.05)。與SAH組比較，NMDP組大鼠躲避反應(yīng)次數(shù)增多，躲避反應(yīng)時間減少(均P<0.05)，而3-MA組差異躲避反應(yīng)次數(shù)及時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后24 h穿梭箱實驗結(jié)果比較

注：Sham組為假手術(shù)組，只進行血管分離并不刺破血管；SAH組為蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組；NMDP組為SAH+尼莫地平組，造模成功后30 min 腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)；3-MA組為SAH+尼莫地平+3-甲基腺嘌呤(3-MA)組，于造模前1 h腹腔注射3-MA(10 mg/kg)，且造模成功后30 min腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)；與Sham組比較,aP<0.05；與SAH組比較,bP<0.05,cP>0.05

2.2 HE染色結(jié)果

Sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞多正常形態(tài)，胞質(zhì)紅色均勻，胞核清晰；SAH組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列紊亂，細胞核深染，可見核固縮、核碎裂等。見圖1。4組大鼠正常形態(tài)神經(jīng)細胞數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.575,P<0.01)。與Sham組比較，SAH組正常的神經(jīng)細胞數(shù)目減少[(72±28)個比(118±27)個，P<0.05]；與SAH組比較，NMDP組正常形態(tài)神經(jīng)細胞數(shù)目明顯增多[(86±20)個，P<0.05]，3-MA組正常形態(tài)神經(jīng)細胞數(shù)目差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(74±24)個，P>0.05]。

2.3 免疫組化結(jié)果

Beclin-1及LC3-Ⅱ陽性蛋白表現(xiàn)在細胞質(zhì)中呈淺棕色顆粒，Sham組可見少數(shù)細胞質(zhì)中淺棕色顆粒，SAH組可見多數(shù)細胞質(zhì)中表達棕色顆粒。見圖2，3。與Sham組比較，SAH組Beclin-1及LC3-Ⅱ陽性細胞增多(均P<0.05)。NMDP組Beclin-1及LC3-Ⅱ陽性細胞較SAH組增多(均P<0.05)，3-MA組Beclin-1及LC3-Ⅱ陽性細胞與SAH組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

2.4 Western blotting結(jié)果

Sham組中Beclin-1蛋白表達水平均較低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 值較??；與Sham組比較，SAH組Beclin-1蛋白的表達水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值上升(均P<0.05)；與SAH組比較，NMDP組Beclin-1蛋白表達水平增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值上升(均P<0.05)，而3-MA組Beclin-1蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見圖4，表3。

表2 各組大鼠陽性神經(jīng)細胞數(shù)目比較

注：Sham組為假手術(shù)組，只進行血管分離并不刺破血管；SAH組為蛛網(wǎng)膜下腔出血模型組；NMDP組為SAH+尼莫地平組，造模成功后30 min 腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)；3-MA組為SAH+尼莫地平+3-甲基腺嘌呤組，于造模前1 h腹腔注射3-甲基腺嘌呤(10 mg/kg)，且造模成功后30 min腹腔注射尼莫地平(0.2 mg/kg)；Beclin-1為自噬的表達相關(guān)蛋白；LC3-Ⅱ為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 Ⅱ；與Sham組比較,aP<0.05；與SAH組比較,bP<0.05,cP>0.05

表3 各組大鼠Western blotting結(jié)果比較

組別鼠數(shù)(只)Beclin-1/GAPDHLC3-Ⅱ/LC3-ⅠSham組60.36±0.03a0.20±0.05aSAH組60.59±0.12a0.51±0.13aNMDP組60.97±0.24b0.87±0.12b3-MA組60.62±0.17c0.49±0.08cF值15.26043.666P值<0.0100<0.0100

注：各組別注同圖4；Beclin-1為自噬的表達相關(guān)蛋白；GAPDH 為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；LC3-Ⅱ為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 Ⅱ；LC3-Ⅰ為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 Ⅰ；與Sham組比較,aP<0.05；與SAH組比較,bP<0.05,cP>0.05

3 討論

尼莫地平是一種經(jīng)典的鈣離子抑制劑，易通過血-腦屏障抑制血管平滑肌收縮，改善血管痙攣及神經(jīng)細胞的缺血缺氧，從而改善神經(jīng)細胞損傷[8-9]。研究結(jié)果表明，SAH后海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞受到損傷，其機制可能是改變了蛛網(wǎng)膜下腔腔隙，導(dǎo)致肌球蛋白與肌動蛋白發(fā)生遷移，引起腦組織缺血、缺氧[10-11]。本研究結(jié)果表明，SAH后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的形態(tài)改變，損傷的細胞數(shù)目明顯增多，大鼠的學(xué)習(xí)能力減弱，與既往研究報道一致。

適度自噬在真核細胞中是一種保護性機制，其利用溶酶體酶對受損的細胞器和蛋白質(zhì)進行降解，維持組織及機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，減弱外界刺激對機體產(chǎn)生損傷[12-13]。Beclin-1是自噬的守護蛋白且是自噬激活的干預(yù)靶點，LC3是細胞膜表面參與自噬小體形成的蛋白。自噬過程中，LC3-Ⅰ 經(jīng)過泛素化在自噬小泡膜表面與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ[14]。 Beclin-1和LC3-Ⅱ 是自噬研究的標(biāo)志性蛋白。有研究結(jié)果表明，自噬的激活對多種腦損傷發(fā)揮保護性作用[7]。Lee等[15]研究結(jié)果表明，大鼠SAH模型中自噬水平明顯升高，在SAH后24 h自噬達到高峰，且對神經(jīng)細胞起到了保護性作用。另有研究結(jié)果表明，SAH模型中大腦皮質(zhì)中自噬的表達增加，且自噬激活劑雷帕霉素干預(yù)后可進一步增加自噬的表達，早期腦損傷如腦水腫、神經(jīng)細胞凋亡、血-腦屏障通透性及神經(jīng)功能等明顯改善[16-17]。本研究應(yīng)用尼莫地平對SAH大鼠進行體內(nèi)實驗觀察其影響，結(jié)果表明，SAH組海馬CA1區(qū)自噬水平升高，NMDP組自噬水平較SAH組進一步升高，研究結(jié)果與以上研究一致，表明SAH后應(yīng)用尼莫地平進行干預(yù)，自噬被激活，從而改善神經(jīng)細胞損傷。尼莫地平對自噬的影響可能是通過鈣離子相關(guān)通路發(fā)揮作用，其涉及的具體作用機制有待于更進一步研究。

綜上所述，尼莫地平增強了海馬CA1區(qū)自噬的激活，減少了神經(jīng)細胞的損傷，改善了大鼠神經(jīng)功能。