李娜，崔夢君，馬佳佳，余海忠，張振東，郭壯，2，趙慧君，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

腐乳，又稱豆腐乳，是一種中國傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品，也是由微生物作用的代表性豆制品[1]。根據(jù)加工方式不同，腐乳可分為細(xì)菌型腐乳、霉菌型腐乳、酶法發(fā)酵以及自然發(fā)酵腐乳[2]。在腐乳自然發(fā)酵過程中，由于制作環(huán)境和人工因素等的影響，導(dǎo)致其蘊含的微生物的種類豐富多樣，從而使腐乳具有別樣風(fēng)味。眾多學(xué)者對腐乳中微生物群落構(gòu)成進(jìn)行了研究，其中程永強等[3]在低溫發(fā)酵腐乳中發(fā)現(xiàn)1 株嗜低溫的毛霉——黃色毛霉（Mucor flavus），同時姚翔等[4]在益陽自然發(fā)酵腐乳中分離出總狀毛霉（Mucor racemosus）和魯氏毛霉（Mucor roxianus），而魯菲等[5]在青方腐乳中分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和短小奇異菌，然而關(guān)于湖北地區(qū)腐乳微生物多樣性的研究較少。

變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)是一種可以對微生物的群落結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性進(jìn)行連續(xù)分析的技術(shù)[6]，同時具有重復(fù)性好、檢測結(jié)果可靠以及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點[7]，目前應(yīng)用于葡萄酒[8]、香腸[9]和奶酪[10]等領(lǐng)域。Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)可以從宏基因組層面對樣品中的微生物多樣性進(jìn)行全方位且客觀的分析評價，同時克服了傳統(tǒng)微生物學(xué)手段耗時長、工作量大等缺點[11]，廣泛應(yīng)用于研究腸道菌群[12]、發(fā)酵食品[13]以及環(huán)境檢測[14]等方面。

本試驗以恩施地區(qū)自然發(fā)酵腐乳為研究對象，利用PCR-DGGE 結(jié)合Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)相結(jié)合的手段對腐乳中的微生物群落組成及多樣性進(jìn)行解析，同時利用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法分離鑒定腐乳中的乳酸菌。通過本研究的開展，可促進(jìn)腐乳產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為大豆發(fā)酵食品領(lǐng)域提供一個重要的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采購于恩施市菜市場。

三羥甲基氨基甲烷（分析純）、乙酸（分析純），乙二胺四乙酸（分析純）、丙烯酰胺（分析純）、甲叉雙丙烯酰胺（分析純）、去離子甲酰胺（分析純）、（分析純）、過硫酸銨（分析純）、四甲基乙二（分析純）、乙醇（分析純）、冰醋酸（分析純）、甲醛（分析純）、硝酸銀（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、MRS 合成培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01 DNA 提取試劑盒、DNA marker、PCR 清潔試劑盒：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2xPCR mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP mix、pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司；正向引物338F（加入7 個核苷酸標(biāo)簽barcodes）和反向引物806R、PCR 引物合成和測序：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VeritiTM 96-well thermal cycler PCR 儀、NanoDrop 2000/2000c：美國 Thermo Fisher 公司；DCodeTM System：美國Bio Red 公司；DYY-12 電泳儀：北京六一儀器廠；Miseq PE300 高通量測序平臺：美國Illumina 公司；R920 機(jī)架式服務(wù)器：美國 DELL 公司；CT15RE 冷凍離心機(jī)：日本HITACHI 公司；Bio-5000 plus 掃描儀：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250 厭氧工作站：英國DWS 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品宏基因組提取與檢測

采用試劑盒方法提取腐乳樣品中的宏基因組，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，測定各樣品宏基因組DNA 濃度。

1.3.2 PCR-DGGE

將宏基因組DNA 濃度調(diào)整為一致后作為模板細(xì)菌16S rRNA V3 區(qū)域基因片段PCR 擴(kuò)增。采用25 μL體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：10×PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各 0.5 μL，rTaq 0.5 μL，模板1 μL，滅菌超純水補充至25 μL。其中上游引物為ALL-GC-V3F（5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCG GCCCGGGGGCACCGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物為 ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）。擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min，95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用8%的聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=38.93 ∶1.07，質(zhì)量比）、變性范圍為35%～52%（100%變性劑：尿素42 g，去離子甲酰胺40 mL）的凝膠進(jìn)行分析。將凝膠置于溫度為60 ℃的0.5 x TAE 電泳緩沖液中，于每個膠孔點樣10 μL，先電壓120 V，持續(xù)80 min 后，電壓80 V，持續(xù)13 h。電泳結(jié)束后，采用硝酸銀法染色，使用掃描儀對電泳圖進(jìn)行觀察拍照，找出各泳道優(yōu)勢條帶并切膠，將膠塊搗碎于50 μL 無菌超純水中，4 ℃靜置過夜。用不含GC 夾的引物（ALL-V3F 和ALL-V3R）將回收膠塊進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及條件同DGGE 擴(kuò)增。用清潔試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，并與載體（PMD18-T）連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆培養(yǎng)，篩選陽性克隆進(jìn)行測序。使用BioEdit 軟件將去除載體序列后在NCBI 中進(jìn)行同源性比對。

1.3.4 樣品細(xì)菌16S rRNA PCR 擴(kuò)增及Miseq 高通量測序

參考王玉榮等[15]方法進(jìn)行樣品細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增及Miseq 高通量測序。采用20 μL 擴(kuò)增體系：5×PCR 緩沖液 4 μL，dNTP mix 2 μL，上游引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和下游引物 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）各 0.8 μL，rTaq 酶0.4 μL，模板 10 ng，滅菌超純水補充至 20 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共運行 30 個循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，合格后進(jìn)行高通量測序。

1.3.5 序列拼接及質(zhì)量控制

參照于丹等[16]和陳澤斌等[17]的方法，在除去不合格序列、barcode 序列和引物序列的基礎(chǔ)上，將數(shù)據(jù)序列進(jìn)行拼接。同時利用PyNAST 軟件將所有的序列對齊，采用UCLUST 算法將相似度＞97%序列劃分為一個操作單元（operational taxonomic units，OTU），從而進(jìn)行物種鑒定和相對含量分析，對腐乳中的微生物多樣性進(jìn)行解析。

1.3.6 腐乳中乳酸菌的分離與鑒定

腐乳樣品中乳酸菌的分離采用倍比稀釋涂布法。將各樣品稀釋液涂布于改良MRS 固體培養(yǎng)基（含1.5%CaCO3）上，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑選具有不同特征且透明圈現(xiàn)象明顯的菌落劃線純化。純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、過氧化氫試驗及凍存。參考文獻(xiàn)[18]提取各菌株DNA，并參照張曉輝等[19]方法使用通用正向引物 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和反向引物 1495R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測序。測序結(jié)果分析同1.3.3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Origin 8.5 軟件對DGGE 圖譜特征條帶序列進(jìn)行統(tǒng)計，同時對樣品的稀釋曲線及香農(nóng)指數(shù)曲線（shannon diversity index curve）的作圖。系統(tǒng)發(fā)育樹由BioEdit 軟件和MEGA 5.0 軟件共同繪制。使用Office 2016 繪制平均相對含量＞5%的屬水平餅圖。Venn 圖由在線繪圖網(wǎng)頁（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）進(jìn)行繪制。相對含量＞1.5%的核心OTU熱圖由Matlab 2010b 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳中細(xì)菌DGGE圖譜及分析

本研究首先使用變性梯度凝膠電泳技術(shù)對樣品16SrRNAV3 區(qū)域細(xì)菌群落組成進(jìn)行研究，如圖1所示。

圖1 腐乳細(xì)菌PCR-DGGE 圖譜Fig.1 PCR-DGGE analysis of bacteria in sufu

由圖1可知，圖譜中共出現(xiàn)6 條明亮的條帶，同時條帶 1、2、4、5 和 6 是兩個樣品的共有條帶，說明不同腐乳樣品中存在一些共有的細(xì)菌種群，其中條帶1 最亮且存在于兩個樣品中，說明此條帶所對應(yīng)的細(xì)菌在腐乳中發(fā)揮著重要的作用。值得一提的是各條帶亮度不同，條帶2 和條帶5 在FR01 中亮度較高，條帶6 在FR02 中亮度較高，表明在細(xì)菌種群豐富度存在差異。而條帶3 僅存在FR02 樣品中，說明不同腐乳樣品中存在著不同的細(xì)菌菌群。進(jìn)一步將各條帶進(jìn)行序列分析，結(jié)果如表1所示。

表1 腐乳細(xì)菌DGGE 比對結(jié)果Table 1 Blast results of bacteria DGGE in sufu

由表1可知，各條帶序列與數(shù)據(jù)庫中16S rRNA序列均具有較高的相似度。其中條帶1 和2 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），條帶3 為嗜鹽芽孢桿菌屬細(xì)菌（Halobacillus karajiensis），條帶 4 為不動桿菌屬細(xì)菌（Acinetobacter oryzae），條帶5 為熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens），條帶6 為嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）。由此可知，腐乳樣品中微生物構(gòu)成具有多樣性，而且隸屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為優(yōu)勢細(xì)菌。陳穎慧[20]利用PCR-DGGE 技術(shù)對4 種不同品牌腐乳中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）和屎腸球菌（Enterococcus Faecium）在各腐乳樣品中均存在，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢細(xì)菌。陳浩等[21]利用構(gòu)建16S rRNA 基因文庫的方法對豆醬樣品進(jìn)行研究， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）為優(yōu)勢細(xì)菌，同時不動桿菌（Acinetobacter baylyi）也被檢測到存在于樣品中。王夫杰等[22]在青方腐乳中分離出植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等乳酸菌。這與上述結(jié)論相一致。

本研究進(jìn)一步將各條帶序列與模式菌株序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果圖2所示。

圖2 腐乳中細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacteria in sufu

由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹被分為2 大分支，其中條帶1 和2 與Lactobacillus plantarum 聚為一類，條帶6與Tetragenococcus halophilus 聚為一類，條帶 3 與Halobacillus karajiensis 聚為一類。而條帶4 和條帶5聚集在另外一支上，其中條帶4 和Acinetobacter oryzae聚為一類，條帶5 和Pseudomonas fluorescens 聚為一類。由此可知。不同腐乳樣品中細(xì)菌群落構(gòu)成存在一定的差異性。

2.2 序列豐富度及多樣性分析

通過Miseq 高通量測序發(fā)現(xiàn)，兩個樣品共產(chǎn)生78 412 條高質(zhì)量16S rRNA 序列。本研究采用兩步UCLUST 算法分別以100%和97%的相似度進(jìn)行序列劃分并建立OTU，首先根據(jù)100%相似度進(jìn)行序列劃分得到33 254 條序列，根據(jù)97%相似度進(jìn)行OTU 劃分后得到2 317 個OTU，平均每個樣品1 158 個OTU。當(dāng)樣品測序量為36 219 條序列時，F(xiàn)R02 樣品具有最大的細(xì)菌物種豐富度同時細(xì)菌多樣性最高，其Chao 1指數(shù)為611，Shannon 指數(shù)為5.64。進(jìn)一步通過稀疏曲線和香農(nóng)指數(shù)曲線圖對各樣品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量來判定是否滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析，其結(jié)果如圖3所示。

由圖3A 可知，隨著測序量不斷的增加，各樣品被發(fā)現(xiàn)OTU 的數(shù)量也隨之增加，而由圖3B 可知，當(dāng)序列數(shù)達(dá)到10 000 條時，各樣品的香農(nóng)多樣性曲線已處于飽和狀態(tài)，由此可知隨著測序序列數(shù)的增加，盡管會有新的細(xì)菌種系型出現(xiàn)，但其多樣性不再發(fā)生變化，可以反映樣品中絕大多數(shù)微生物物種信息。因而本研究中每個樣品產(chǎn)生的序列數(shù)是可以將樣品中細(xì)菌微生物多樣性表現(xiàn)出來，同時可以滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析需求。

2.3 基于不同分類地位腐乳樣品核心細(xì)菌菌群相對含量分析

納入本研究的序列被鑒定為14 個門，24 個綱，53 個目，84 個科，145 個屬，其中只有5.3%的序列不能鑒定到屬水平。研究發(fā)現(xiàn)腐乳樣品中平均相對含量＞1%的細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和硬壁菌門（Firmicutes），其含量分別為80.45%、10.7%和6.81%。同時在2 個樣品中隸屬于變形菌門（Proteobacteria）的細(xì)菌相對含量分別為77.29%和83.61%，隸屬于擬桿菌門（Bacteroidetes）的細(xì)菌相對含量為17.19%和4.22%，而隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）的細(xì)菌相對平均含量為3.76%和9.87%。由此可知，在門水平上各樣品中的微生物存在差異，本試驗進(jìn)一步對各樣品在屬水平上進(jìn)行分析，如圖4所示。

圖3 稀疏曲線圖和香農(nóng)指數(shù)曲線圖Fig.3 Rarefaction curve and Shannon diversity index curve

圖4 腐乳中優(yōu)勢細(xì)菌屬平均相對含量比較分析Fig.4 Comparative analysis the dominant bacterial genera with average relative abundance in sufu

由圖4可知，腐乳樣品中平均相對含量＞5%的細(xì)菌屬包括綠膿桿菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、布丘氏菌屬（Buttiauxella）和草螺菌屬（Herbaspirillum），其平均相對含量分別為33%、10.56%、8.82%、6.57%和6.32%。然而各細(xì)菌屬在2 個樣品中的相對含量均存在很大差異，其中綠膿桿菌屬（Pseudomonas）的相對含量分別為22.56 %和43.46 %，同時不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對含量分別為18.68%和2.43%，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）的相對含量分別為16.77%和0.88%，這與PCR-DGGE 結(jié)果相一致。劉亞棟[23]利用16S rDNA 測序的方法對腐乳中的微生物多樣性進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變形菌門（Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為腐乳樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌門，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、鹽單胞菌屬（Halanaerobium）、Rummeliibacillus 屬和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）均為腐乳匯樣品中的優(yōu)勢屬，這與本文結(jié)論一致。

本試驗進(jìn)一步統(tǒng)計了OTU 在兩個樣品中出現(xiàn)次數(shù)，如圖5所示。

圖5 基于OTU 水平的Venn 圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由圖5可知，在兩個腐乳樣品中出現(xiàn)1 次的OTU數(shù)量分別為1 144 個和1 432 個，分別占OTU 總數(shù)的43.8%和54.9%，序列數(shù)分別為2 183 條和5 426 條。同時核心OTU 共有34 個，占OTU 總數(shù)的1.3%，包含70 802 條序列。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有9 個核心OTU 的相對含量＞1.5%，結(jié)果如圖6所示。

圖6 相對含量＞1.5%的核心OTU 熱圖Fig.6 Heat map of the relative abundance more than 1.5%of cores OTUs

由圖6可知，OTU874 和 OTU1711 隸屬于綠膿桿菌屬（Pseudomonas），OTU1671 和 OTU894 隸屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），OTU577 隸屬于沙雷菌屬（Serratia），OTU1973隸屬于短波單胞菌屬（Brevundimonas），OTU1907 隸屬于草螺菌屬（Herbaspirillum），OTU635 隸屬于鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），而OTU346 未鑒定在屬水平，只鑒定在Enterobacteriaceae。同時由圖6可以發(fā)現(xiàn)，OTU874、OTU635 和 OTU1671 在FR01 中含量較高，其相對含量分別為16.89 %、16.73 %和 11.32 %，同時 OTU874 和 OTU1907 在FR02 中含量較高，其相對含量分別為28.56%和11.85%。

2.4 腐乳中乳酸菌分離鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)手段結(jié)合16S rDNA 測序方法對腐乳樣品中的乳酸菌進(jìn)行分離與鑒定，其鑒定結(jié)果和數(shù)據(jù)庫中模式菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖7所示。

圖7 腐乳中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of Lactobacillus in sufu

由圖7可知，在腐乳樣品中共分離出7 株乳酸菌，其中2 株為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），1株為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），4 株為屎腸球菌（Enterococcus faecium）。由此可知，腐乳中乳酸菌種類具有多樣性。

3 結(jié)論

本文使用PCR-DGGE 技術(shù)和Illumina Miseq 第二代高通量測序技術(shù)相結(jié)合的手段對恩施地區(qū)腐乳中的微生物群落組成及多樣性進(jìn)行解析，同時利用傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法對其乳酸菌資源進(jìn)行發(fā)掘。結(jié)果表明：隸屬于變形菌門的綠膿桿菌屬、不動桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、布丘氏菌屬和草螺菌屬為腐乳樣品中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，同時PCR-DGGE 技術(shù)與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法顯示腐乳中的微生物資源較為豐富且具有多樣性。通過本研究的開展，可為傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品提供優(yōu)秀的菌種資源，同時更好地促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。