李朝夕，黃 健，張 姝，何 蕓，陸景潤，劉 敏，莫 非，羅揚(yáng)勇，劉晉廷，黃建軍

作者單位：550001貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)[李朝夕（醫(yī)學(xué)碩士研究生）、陸景潤、劉 敏、羅揚(yáng)勇、劉晉廷]；400038重慶，陸軍軍醫(yī)大學(xué)臨床檢驗(yàn)教研室（黃 健、張 姝）；550001貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心（何 蕓、莫 非），乳腺外科（黃建軍）

0 引 言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，目前乳腺癌的分子機(jī)制不明［1］。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一類21～25個核苷酸的非編碼RNA，由可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)［2］。Marilena等［3］發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中大部分miRNA呈現(xiàn)異常表達(dá)。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤患者中異常表達(dá)的miRNA影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移過程，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Liu等［4］發(fā)現(xiàn)，miR-21通過抑制促細(xì)胞凋亡因子PDCD4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，當(dāng)抑制其表達(dá)時，乳腺癌細(xì)胞增殖受到抑制。同時由于miRNA不易被降解，能耐受反復(fù)凍融和極端pH環(huán)境，且相比于蛋白質(zhì)標(biāo)志物，miRNA表達(dá)異常在機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)得更早，因此miRNA作為腫瘤早期篩查和診斷、預(yù)后判斷以及藥物選擇、療效檢測的分子標(biāo)記物，有著獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究擬通過高通量測序?qū)ふ业奖磉_(dá)差異的miRNA，并擴(kuò)大樣品檢測miRNA及其靶基因EZH2在乳腺癌癌旁組織、乳腺纖維腺瘤、乳腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后乳腺癌組織中的表達(dá)，分析差異表達(dá)的miRNA生物學(xué)功能及其對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，以期為闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PureLink?miRNA Isolation Ki（t貨號K157001）、Quant-iT? RNA Assay Kit（invitrogen，貨號 Q33140）、Small RNA Sample Prep Kit（Arraystar，貨號AS-MB-012-02）、熒光定量PCR試劑盒（貨號E090）、電化學(xué)發(fā)光ECL試劑盒（貨號WBKLS0500）及HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（貨號CST#7074）均購自CST工程有限公司，兔抗人EZH2（貨號ab186006）抗體購自美國Abcam公司。

1.2 使用儀器 NanoDropD-1000微量核酸定量儀購自美國Thermo公司，7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。超純水儀Millipore，臺式高速離（Hettich MIKRO 120），紫外分光光度儀（日本島津UV-1800）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 收集2015年1月至2018年12月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科137例手術(shù)切除的乳腺癌組織及癌旁組織（距離癌組織＞2 cm），標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)。患者術(shù)前均未接受過放療及內(nèi)分泌治療?；颊吣挲g30～69歲，平均年齡（55.5±9.5）歲。并收集同時期的乳腺良性病變20例作為對照，病理診斷均為乳腺纖維腺瘤。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2019032K），患者均簽署知情同意書。

1.3.2 組織樣品RNA的提取 將切碎的乳腺組織置于無菌微量離心管中，加入300 μL緩沖液，完全浸沒在緩沖液中，組織勻漿。以12 000×g離心組織勻漿液5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，加入300 μL 70%乙醇后用渦旋混合均勻。接著將上清液采用PureLink?miRNA Isolation Kit的操作步驟提取純化miRNA。并用Quant-iT?RNA Assay Kit測量純化后的miRNA濃度，電泳方法檢測miRNA的完整性。

1.3.3 miRNA高通量測序 采用Small RNA Sample Prep Kit構(gòu)建miRNA文庫。分別在miRNA的3'端和5'端加上接頭，利用與3'接頭反向互補(bǔ)的引物反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出cDNA，最后進(jìn)行15個循環(huán)的PCR擴(kuò)增獲得miRNA文庫，并利用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序。具體操作由上海康成生物公司完成。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析顯著差異miRNA的靶基因，通過mirBase、TargetScan、DIANA TOOLS和基因雷達(dá)等生物信息網(wǎng)站預(yù)測顯著差異miRNA的靶基因。

1.3.5 qPCR進(jìn)行大樣品的驗(yàn)證 將臨床收集的標(biāo)本組織分為乳腺癌組、癌旁組、乳腺纖維腺瘤組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，每組12個樣品。于-80℃取出癌組織和癌旁組織約2 g，加入液氮研磨，按1.2.2方法進(jìn)行miRNA提取。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計顯著差異的miRNA引物。由上海生工生物工程有限公司合成。其中內(nèi)參U6的引物序列為GCACTGGATACGACGACAAAATATGGAAC以及GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT，hsa-miR-532-3p引物序列為GCCCATGCCTTGAGTCTAG和GTGCCTGTCGTGGAGTCC，hsa-miR-1260b引物序列為CGTGCTGGAACACGGTAAAA和GCAGCCAACTCAGCTTCCTT，hsa-let-7c-5p引物序列為GAGGTAGTAGGTTGTATGGTTG和GCAGGGTCCGAGGTATTC，EZH2引物序列為CCAAGAGAGCCATCCAGACT和ATTGCCCACAGTACTCGAGG。根據(jù)SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，以2-△△CT法計算基因的相對表達(dá)量。

1.3.6 Western blot檢測組織中EZH2蛋白表達(dá)水平 取手術(shù)切除的乳腺癌和癌旁組織，置于2 mL勻漿器中，加入400 μL PMSF去污劑裂解液在冰上勻漿。冰上裂解30 min，反復(fù)振蕩，將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃12 000×g離心5 min，取上清液分裝于1.5 mL離心管中。用Brady Buffer法測定總蛋白濃度。將樣品蛋白煮沸10 min。取30 μg總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜用TBST緩沖液漂洗1 min，室溫封閉2 h，TBST漂洗PVDF膜1次后，于1∶1000稀釋的一抗孵育過夜，TBST漂洗3次，每次10 min，將清洗好的PVDF膜放入1∶100 000羊抗兔二抗室溫孵育1 h，ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶吸光度值。蛋白相對表達(dá)量為目標(biāo)條帶吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，轉(zhuǎn)染前1 d取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)大約為3×105個，次日細(xì)胞密度達(dá)到60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，使用Lipofectamine 2000將hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b、hsa-let-7c-5p的干擾質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中，得到沉默表達(dá)的si-hsa-miR-532-3p、si-hsa-miR-1260b、sihsa-let-7c-5p和過表達(dá)的LV-hsa-miR-532-3p、LV-hsa-miR-1260b、LV-hsa-let-7c-5p，并設(shè)立陰性對照（NC）及空白對照（blank），轉(zhuǎn)染8 h后，將無血清培養(yǎng)基更換為含10%FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后用熒光定量PCR分別檢測各組乳腺癌細(xì)胞中hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b、hsa-let-7c-5p和 EZH2的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用HiSeq2000測序統(tǒng)計軟件及SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。差異miRNA篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05，校正P值 ＜0.05，miRNA表達(dá)值倍數(shù)變化（Fold change，F(xiàn)C）≥3。定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間均值比較釆用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩組間比較采用LSD法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌患者臨床病理特征 137例乳腺癌患者中，EZH2陽性者及陰性者在腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、分子亞型方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 miRNA異常表達(dá)譜的篩選 高通量測序后通過FC＞3倍變化且P＜0.05篩選組間的差異表達(dá)miRNA表達(dá)譜，結(jié)果篩選出157個上調(diào)表達(dá)的miRNA和162個下調(diào)表達(dá)的miRNA。見圖1。其中上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最高的前15位miRNA見表2。

表1 乳腺癌患者臨床病理特征[n(%)]Table 1 Clinicopathologic features of breast cancer patients n(%)

表2 乳腺癌組織及癌旁組織中miRNA的表達(dá)變化Table 2 Expression of miRNA in breast cancer tissues and para-cancerous tissues

圖1 高通量測序MicroRNA表達(dá)火山圖Figure 1 High throughput sequencing of miRNA expression in volcanic maps

2.3 生物信息學(xué)分析 對差異最為顯著的30個miRNA的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其中上調(diào)的9個miRNA的靶基因?yàn)镋ZH2基因，占60%；下調(diào)的7個miRNA的靶基因?yàn)镋ZH2基因，占47%。見圖2。

圖2 靶基因的預(yù)測Figure 2 Target gene prediction

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證 表達(dá)差異最為明顯有3個miRNA，其中上調(diào)的是hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b，下調(diào)的是hsa-let-7c-5p。與癌旁組比較，乳腺癌組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）；乳腺癌組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組hsa-let-7c-5p明顯下調(diào)（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各基因在各組組織中的表達(dá)情況Figure 3 Expression of gene in tissue

2.5 qRT-PCR測量差異miRNA對EZH2 mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示沉默hsa-miR-532-3p或hsa-miR-1260b后，EZH2的表達(dá)均降低，過表達(dá)時則升高；沉默hsa-let-7c-5p后EZH2表達(dá)升高，過表達(dá)hsa-let-7c-5p后EZH2表達(dá)降低。見表3。

表3 miRNA對EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Table3 Effect of miRNA on EZH2 mRNA expression

2.6 Western blot檢測沉默及過表達(dá)miRNA后EZH2蛋白的表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，沉默hsa-miR-532-3p或hsa-miR-1260b后，EZH2蛋白表達(dá)均降低，過表達(dá)時其升高；沉默hsa-let-7c-5p后EZH2蛋白表達(dá)升高，過表達(dá)hsa-let-7c-5p后EZH2蛋白表達(dá)降低。進(jìn)一步提示hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b、hsa-let-7c-5p可調(diào)控 EZH2的表達(dá)，其中hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b呈正向調(diào)控，hsa-let-7c-5p呈負(fù)向調(diào)控，見圖4。

圖4 Western blot檢測沉默及過表達(dá)miRNA后EZH2蛋白的表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of EZH2 protein after miRNA silencing and overexpression were detected by Western blot

2.7 EZH2 mRNA及蛋白的表達(dá) 乳腺纖維腺瘤組、乳腺癌組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組EZH2 mRNA表達(dá)量（1.24±0.01，4.02±0.01，15.97±0.01）較癌旁組（1.00±0.00）明顯升高（P＜0.05）；EZH2蛋白表達(dá)量（1.39±0.00、10.78±0.09、12.82±0.07）較癌旁組（1.00±0.00）亦明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 EZH2蛋白表達(dá)Figure 5 Expression of EZH2 and β-actin proteins

3 討 論

中國乳腺癌的發(fā)病率和病死率居高不下，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢，其具體發(fā)病機(jī)制仍尚未明確，近年來隨著分子生物的發(fā)展，乳腺癌診斷與治療已經(jīng)進(jìn)入到了分子和基因水平。研究報道m(xù)iRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但有強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控作用，可以與特定mRNA結(jié)合或調(diào)節(jié)特定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程，以此調(diào)控基因的表達(dá)［5-6］，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程［7-9］。

研究發(fā)現(xiàn)，有的miRNA高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和浸潤，有的則發(fā)揮抑制作用［10］。本研究利用miRNA高通量測序技術(shù)及實(shí)時熒光PCR對乳腺癌組織及癌旁組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)倍數(shù)最大的是hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b。 hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b是近幾年新發(fā)現(xiàn)的miRNA，在其他腫瘤中顯示出重要作用，在乳腺癌中未見報道，Zhou等［11］發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中miR-532-3p升高，人參皂苷能促進(jìn)miR-532-3p抑制己糖激酶的催化作用。提示干擾miR-532-3p能抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解過程，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖浸潤，發(fā)揮抑癌作用。Xu等［12］研究報道，抑制hsa-miR-1260b的表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌癌細(xì)胞的增殖及抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而抑制細(xì)胞的浸潤。另有研究報道，hsa-miR-1260b在前列腺癌、腎癌中呈高度表達(dá)，木黃酮通過下調(diào)hsa-miR-1260b表達(dá)而抑制Wnt信號通路作用［13-14］，提示干擾hsa-miR-1260b能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤過程。綜上提示hsa-miR-532-3p、hsamiR-1260b的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤密切相關(guān)，抑制其表達(dá)可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本研究hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b在乳腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織及乳腺纖維腺瘤組織；與癌旁組織相比，hsamiR-532-3p在纖維腺瘤組織、乳腺癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織呈現(xiàn)逐漸上調(diào)的趨勢；而hsa-miR-1260b在乳腺癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織呈高表達(dá)，但在纖維腺瘤組織表達(dá)差異不顯著。提示hsa-miR-532-3p及hsa-miR-1260b過表達(dá)增加了乳腺癌發(fā)病風(fēng)險。其可能參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移過程。

hsa-let-7家族在腫瘤組織中具有抑制癌基因作用，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。通常根據(jù)let-7的表達(dá)水平將腫瘤細(xì)胞分為2類，其中l(wèi)et-7表達(dá)低的腫瘤細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞的特性，與細(xì)胞惡性程度密切相關(guān)，具有提示腫瘤惡性程度的指示作用。曲杰等［15］研究報道，將合成的hsa-let-7b轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，明顯降低了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Kong等［16］發(fā)現(xiàn)，EZH2基因的表達(dá)可以被hsa-let-7負(fù)向調(diào)控，進(jìn)而使前列腺癌細(xì)胞的增殖受到影響。本研究通過測序發(fā)現(xiàn)該家族成員hsa-let-7c-5p下調(diào)最為明顯，特別在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的癌組織下調(diào)倍數(shù)更為明顯，因此推斷其具有間質(zhì)細(xì)胞的特性，在下一步的實(shí)驗(yàn)中將加以證實(shí)。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b與 hsa-let-7c-5p靶 基 因 均 為EZH2。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在正常機(jī)體細(xì)胞中受到磷酸化修飾及多種miRNA調(diào)節(jié)作用而過度表達(dá)，進(jìn)而抑制了轉(zhuǎn)錄過程，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖及浸潤，當(dāng)敲除腫瘤細(xì)胞EZH2基因后，細(xì)胞的侵襲性會相應(yīng)降低［17］。目前已有研究報道，EZH2在乳腺癌中呈過表達(dá)，且可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移［18-20］。本研究發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白在乳腺纖維腺瘤、乳腺癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中的miRNA表達(dá)量較癌旁組織上調(diào)；且蛋白表達(dá)趨勢與miRNA表達(dá)一致，進(jìn)一步證實(shí)EZH2與乳腺癌密切相關(guān)，其可能是乳腺癌細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)鍵分子。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b及hsa-let-7c-5p與乳腺癌密切相關(guān)，其可能通過調(diào)控EZH2在乳腺癌中的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，hsa-miR-532-3p、hsa-miR-1260b、hsa-let-7c-5p及EZH2可能成為乳腺癌潛在的腫瘤生物標(biāo)志物，但其具體的機(jī)制以及在臨床診療的應(yīng)用中還有待進(jìn)一步探索和研究。