張伊儂，董唯，徐毅,2,3，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)

冷凍是生鮮肉制品最有效、最常用的貯藏手段。然而在實際生產(chǎn)中，冷鏈技術(shù)并不完善，肉類從屠宰、加工到零售等環(huán)節(jié)中，外界溫度波動較大，產(chǎn)品會不可避免地經(jīng)受反復(fù)凍融[1]，造成內(nèi)部冰晶體重結(jié)晶，破壞細胞組織的結(jié)構(gòu)，造成營養(yǎng)物質(zhì)流失，并加快蛋白質(zhì)的冷凍變性，同時產(chǎn)品的色澤、保水性和質(zhì)構(gòu)也會發(fā)生變化，肉的食用價值及加工品質(zhì)大大降低，給屠宰和深加工企業(yè)帶來極大的損失。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注并嘗試解決反復(fù)凍融給鮮肉品質(zhì)帶來的問題。祝凱麗[2]發(fā)現(xiàn)，隨著反復(fù)凍融次數(shù)的增加，生鮮肉的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)含量、乳化性、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性都呈降低的趨勢，蛋白質(zhì)的凝膠化作用也受到影響，但添加海藻酸鈉的MP再經(jīng)過同樣凍融處理后，其變性情況得到明顯改善。郭銳等[3]將κ-卡拉膠和復(fù)合磷酸鹽添加到反復(fù)凍融豬肉中制成香腸，與對照組相比，處理組香腸的出品率和保水性顯著提高，其質(zhì)構(gòu)性能以及內(nèi)部水分分布也有所改善。目前來看，關(guān)于改善反復(fù)凍融肉制品的品質(zhì)的研究大多是采用預(yù)防的措施，即在肉品發(fā)生凍融之前預(yù)先加入添加劑，以防凍融后蛋白質(zhì)特性受到較大影響，但此類方法不適用于已經(jīng)發(fā)生凍融損傷的肉制品，有較大的局限性。

研究表明，超聲波能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)造，引起蛋白質(zhì)次級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而改變蛋白質(zhì)的功能特性[4]。然而，目前應(yīng)用物理方法處理反復(fù)凍融肉制品的研究鮮有報道。本文采用超聲波對反復(fù)凍融雞肉進行處理，考察其對MP的功能特性的處理效果，并進一步探究超聲波處理對MP功能特性修復(fù)的機理，以期為反復(fù)凍融肉類原料的科學(xué)利用、改善深加工產(chǎn)品的品質(zhì)、提高加工出品率和企業(yè)經(jīng)濟效益等提供一定的技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，選取同批次新鮮白羽雞的雞胸肉，購于重慶市北碚區(qū)永輝超市；大豆油，益海嘉里食品有限公司，購于重慶市北碚區(qū)永輝超市；牛血清蛋白標品、Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl、EDTA、CuSO4(分析純)，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HFJ-25內(nèi)切式勻漿機，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；GL-23MS高速冷凍離心機，湖南賽特湘儀有限公司；CT-3質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司；HR-1流變儀，美國TA公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Spectrun100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

將購置的新鮮雞胸肉去除可見的脂肪及結(jié)締組織，切成均勻的小塊狀，用塑料冷凍包裝袋真空包裝(每袋約200 g)后，放入-18 ℃冰箱中凍藏3 d，然后約10 ℃室溫解凍12 h。如此反復(fù)凍融5次，制備試驗所需的雞肉樣品。

1.3.2 MP的提取以及超聲波處理

MP的提取參考董唯[5]的方法，提取出的MP保藏在4 ℃冰箱中，使用時間不超過3 d。進行超聲波處理時，取適量MP于離心管中，采用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液根據(jù)各指標的測定方法分別調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，然后將離心管固定于超聲清洗器中，超聲功率設(shè)定為420 W，溫度保持在40 ℃，超聲處理時間分別為0、3、6、9、12、15、18 min，然后進行相關(guān)指標的測定。

1.3.3 MP溶解度的測定

用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的濃度[6]，以牛血清蛋白為標準品，所得標準曲線方程為：y=0.076 5x+0.002 6，R2=0.999 8。MP溶解度的計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.4 MP乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

用4℃磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MP溶液，經(jīng)超聲波處理后，其乳化性的測定參照AGYARE等[7]的方法進行。

1.3.5 起泡性的測定

參照JIANG等[8]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷摹Ｓ? ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MP溶液，樣品經(jīng)超聲波處理后，取10 mL樣液高速勻漿，相關(guān)指標按公式(2)和公式(3)計算。

(2)

(3)

式中：V，樣品的初始體積，mL；V0，勻漿后立即測得的泡沫體積，mL；V0.5，勻漿后樣品靜置0.5 h后泡沫的體積，mL。

1.3.6 MP熱誘導(dǎo)凝膠的制備

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2HPO4，pH 6.25)配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL的MP溶液，經(jīng)超聲波處理后，取7 mL樣品于10 mL的離心管中，將其在40℃下水浴20 min，然后在80 ℃下再水浴30 min。操作完成后將離心管放入冰水中，使其快速降溫，從而縮短凝膠形成的時間。制備好的MP凝膠應(yīng)放在4 ℃的冰箱中過夜后再使用。

1.3.7 凝膠硬度和彈性的測定

取出制備好的凝膠樣品，在室溫下放置30 min，去除表面水分，將凝膠樣品修整為約1 cm厚的規(guī)則圓柱體，測定凝膠硬度和彈性，具體參數(shù)的設(shè)置參照董唯[5]的方法。

1.3.8 凝膠保水性的測定

取出制備好的凝膠樣品，室溫下放置30 min后，將凝膠進行離心并記錄相關(guān)質(zhì)量，保水性的計算如公式(4)所示：

(4)

式中：m0，離心管的質(zhì)量，g；m1，離心前凝膠和離心管的質(zhì)量，g；m2，離心后并去除水分后凝膠和離心管的質(zhì)量，g。

1.3.9 MP流變學(xué)特性的測定

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na2HPO4，pH 6.25)配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL的MP溶液，經(jīng)超聲波處理后，參考白登榮等[9]的方法設(shè)定流變儀的參數(shù)。

1.3.10 MP粒徑大小的測定

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCI，20 mmol/L Na2HPO4，pH 6.5)配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MP溶液，經(jīng)超聲波處理后，使用激光粒度儀測定蛋白質(zhì)溶液中粒子大小。具體設(shè)定參數(shù)參考崔姍姍[10]的方法。

1.3.11 MP凝膠巰基含量的測定

稱取10 g凝膠樣品溶解于25 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液A中，均質(zhì)離心后取上清液，并將其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)至1 mg/mL。取0.5 mL蛋白質(zhì)溶液與5 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液B混合，再加入0.1 mL DTNB(0.01 mol/L)，40 ℃條件下保溫25 min后在412 nm處測定溶液的吸光度，計算總巰基含量。緩沖液的配制具體參照ELLMAN[11]的方法?？値€基含量的計算如公式(5)所示：

C0=(A/ε)×(D/ρ)

(5)

式中：C0，總巰基的摩爾濃度，mol/g；A，吸光值；ε，吸光系數(shù)為13 600 M-1cm-1；D，稀釋倍數(shù)；ρ，上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.12 MP SDS-PAGE凝膠電泳

用不連續(xù)的SDS-PAGE對雞肉MP進行分析，具體操作及參數(shù)設(shè)置參考LAEMMLI[12]的方法。

1.3.13 紫外光譜分析

用4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L Na2HPO4，pH 7.0)配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MP溶液，樣品經(jīng)超聲波處理后進行紫外掃描，其速率設(shè)定為10 nm/s，掃描波長為200～600 nm。

1.3.14 紅外光譜分析

提取的MP溶液經(jīng)超聲波處理后，需先制成MP凍干樣品，然后與KBr一起研磨成粉末，制成壓片。具體操作方法及測定條件參考林婉玲等[13]的方法。

1.3.15 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，最終結(jié)果取平均值。用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理，用Origin 8.1軟件進行繪圖，用SPSS Statistics 17.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對MP功能特性的影響

反復(fù)凍融的MP經(jīng)不同時間超聲波處理后部分功能特性變化情況如表1所示。由表1可知，經(jīng)超聲波處理后，從MP的水合性質(zhì)、表面性質(zhì)和凝膠性質(zhì)3方面測得的各指標均顯著大于對照組(P<0.05)，蛋白質(zhì)功能特性得到很大改善。超聲波的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)能對蛋白質(zhì)分子之間的相互作用產(chǎn)生影響[14]，隨著超聲波處理樣品時間的變化，MP分子間的次級鍵也會隨之不停地發(fā)生斷裂或者重新建立，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，相應(yīng)的功能特性也因此發(fā)生變化。超聲波使MP分子鏈慢慢打開，從有序的卷曲緊密結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o序松散的伸展?fàn)顟B(tài)，原本隱藏在結(jié)構(gòu)內(nèi)部的親水基團更多地暴露，形成更易溶于水的非共價鍵分子，水合能力增強，溶解度提高。而蛋白質(zhì)的溶解度又與其他功能特性密切相關(guān)，比如，溶解度的增加能夠促進體系中參與乳化作用的蛋白質(zhì)濃度增加，使油水界面形成更厚的蛋白膜，提高蛋白質(zhì)乳化性[15]。MP的凝膠特性隨超聲波處理時間的延長先升高后降低，在12 min時有很好的硬度、彈性及保水性，可能是因為超聲波使MP中非共價鍵作用力增強，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合地更致密、均勻；但是，如果超聲波處理時間過長(>12 min)，可能會產(chǎn)生過高的局部熱量，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)改變構(gòu)象發(fā)生聚集，部分功能性基團被包埋在蛋白質(zhì)顆粒內(nèi)部，從而使形成的凝膠結(jié)構(gòu)無序而粗糙，凝膠性質(zhì)下降。

表1 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白功能特性的影響

2.2 超聲波對MP流變學(xué)特性的影響

如圖1所示,隨著超聲波處理時間的增加，MP的G′值先增加后降低，并在12和15min時有較高的G′值。在升溫的第1階段，在41～43 ℃時出現(xiàn)了第1個峰值，MP分子被打開，蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，未經(jīng)超聲波處理的蛋白質(zhì)樣品在43.17 ℃時G′達到最大值，為1 236.4 Pa，而超聲波處理組的蛋白質(zhì)樣品出現(xiàn)峰值的時間縮短，且其G′最大值顯著大于未經(jīng)超聲波處理；在第2階段48～50 ℃時出現(xiàn)了第2個峰值，超聲波處理的樣品的G′最小值顯著大于對照組，而且其轉(zhuǎn)變溫度低于對照組；第3階段是隨著溫度的升高，G′值迅速增大，在71～77 ℃時出現(xiàn)了第3個峰值，此時形成了不可逆凝膠，未經(jīng)超聲波處理的蛋白質(zhì)樣品G′在77.10 ℃時達到最大值，而時間為12 min處理組的蛋白質(zhì)樣品G′在73.91 ℃達到最大值34 130.4 Pa，時間為15 min處理組的蛋白質(zhì)樣品G′在74.26℃達到最大值32 392 Pa。與未經(jīng)超聲波處理的蛋白質(zhì)樣品相比，超聲波處理的樣品G′值增大速度較快，G′值發(fā)生轉(zhuǎn)變的溫度點比未經(jīng)超聲波處理組低，且其G′最大值也顯著高于未經(jīng)超聲波處理組，這表明超聲波處理可以降低蛋白質(zhì)形成凝膠的熱變性溫度，提高凝膠的形成能力，這與凝膠彈性和硬度測得結(jié)果基本一致。

圖1 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白存儲模量(G′)的影響

Fig.1 Effects of ultrasonic time on storage modulus (G′)of myofibrillar protein

2.3 超聲波對MP粒度的影響

如圖2所示,隨著超聲波處理時間的增加，MP平均粒徑呈減小的趨勢,當(dāng)處理時間為0～12 min時，超聲波對MP平均粒徑減小的作用十分顯著(P<0.05)，在超聲波處理時間為12 min時，蛋白質(zhì)的平均粒徑達到最小值，為1 315 nm；處理時間超過12 min后粒徑變化不顯著。HU等[16]用高強度超聲波處理大豆蛋白時，發(fā)現(xiàn)超聲波處理減小了蛋白質(zhì)顆粒尺寸，且處理時間越長，粒徑越??；ZHANG等[17]研究超聲波處理花生蛋白時也發(fā)現(xiàn)5、10、15、20、25、30 min超聲處理組的蛋白質(zhì)的平均粒徑比對照組顯著減小。WU等發(fā)現(xiàn)[18]，蛋白質(zhì)的粒徑大小與蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)密切相關(guān)，當(dāng)MP粒徑較小時，更有利于形成致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。本研究中MP凝膠特性以及MP粒徑變化趨勢與WU等[18]的觀點相符，由此可見，強烈的振蕩作用及剪切力使蛋白質(zhì)分子間非共價相互作用遭到破壞，其顆粒被分散和破碎，有利于MP凝膠特性的提高。

圖2 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白平均粒徑的影響

Fig.2 Effects of ultrasonic time on particle size of myofibrillar protein

2.4 超聲波對MP分子質(zhì)量的影響

不同超聲時間處理后的MP經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示，7個時間梯度所處理的MP樣品的電泳條帶無明顯變化，表明處理前后MP的分子質(zhì)量(主要是肌球蛋白和肌動蛋白)分布沒有發(fā)生明顯變化，即MP的一級結(jié)構(gòu)可能沒有明顯發(fā)生變化，而發(fā)生改變的應(yīng)該是MP的高級結(jié)構(gòu)。常海霞等[19]采用不同時間超聲波處理草魚肌肉MP時，發(fā)現(xiàn)處理時間的變化并不會引起MP電泳譜帶較大的變化，也未出現(xiàn)蛋白質(zhì)降解片段或蛋白質(zhì)共價聚集產(chǎn)物，這與本文結(jié)論相似。

M-標準蛋白(marker)；1～7-超聲波處理時間分別為0、3、6、9、12、15、18 min

圖3 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白SDS-PAGE

圖譜的影響

Fig.3 Effects of ultrasonic time on the SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein

2.5 超聲波對MP巰基含量的影響

如圖4所示，隨著超聲時間的增加，MP凝膠巰基含量顯著下降(P<0.05)。與對照組相比，經(jīng)超聲處理3、6、9、12、15、18 min后，其蛋白質(zhì)凝膠巰基分別由對照組的7.11×10-5mol/g降低至6.99×10-5mol/g、6.76×10-5mol/g、6.48×10-5mol/g、6.22×10-5mol/g、6.08×10-5mol/g、5.91×10-5mol/g，分別降低了1.69%、4.92%、8.86%、12.51%、14.49%、16.47%。這一變化可能與超聲波對MP分子鏈的打開作用有關(guān)，超聲波處理使包埋在分子內(nèi)部的巰基暴露出來，而巰基基團與二硫鍵這一維持蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的共價鍵密切相關(guān)，所以某種程度上，巰基含量的降低說明MP分子內(nèi)的二硫鍵重新發(fā)生鍵合，這也必定會導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)改變[20]。劉亞春[21]采用不同方法處理豬肉肌原纖維蛋白，對凝膠機理進行研究時，發(fā)現(xiàn)超聲波處理組的熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)凝膠巰基含量比空白組要低，認為超聲波通過物理作用使巰基轉(zhuǎn)變?yōu)槎蜴I，導(dǎo)致了巰基含量下降。

圖4 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白凝膠巰基含量的影響

Fig.4 Effects of ultrasonic time on sulfhydryl content of gelatin from myofibrillar protein

2.6 超聲波對MP紫外光譜的影響

如圖5所示，隨著超聲時間的增加，MP的紫外吸光度呈先增加后降低的趨勢，處理時間為12 min時紫外吸光度達到最大值。隨著處理時間進一步增加，紫外吸光度略有降低，2個吸收峰分別位于250和270 nm左右。MP產(chǎn)生紫外光譜的原因主要是因為其分子內(nèi)部某些殘基的側(cè)鏈基團可以吸收紫外光，如色氨酸和組氨酸等，其次肽鍵也可以吸收紫外光[22]。而當(dāng)樣品經(jīng)超聲波處理后，MP分子構(gòu)象改變，其中的生色基團被更多地暴露到了表面，相對含量提高，且這些生色基團由原來所處的非極性環(huán)境轉(zhuǎn)換為極性環(huán)境，從而使體系紫外吸光度增加[18]。而超聲波處理時間過長時(>12 min)，蛋白質(zhì)分子可能又會發(fā)生聚集，生色基團相對減少，蛋白質(zhì)紫外吸光度降低。紫外光譜的變化進一步說明超聲波使MP分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而引起其功能特性相應(yīng)的改變。

圖5 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白紫外光譜的影響

Fig.5 Effects of ultrasonic time on the UV spectra of myofibrillar protein

2.7 超聲波對MP紅外光譜的影響

不同超聲波處理時間對MP紅外光譜及二級結(jié)構(gòu)含量變化的影響如圖6所示。通常蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-折疊被包埋在多肽鏈的內(nèi)部，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)緊密且無空腔，是非常穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[23]。隨著處理時間的增加，MP中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量顯著降低(P<0.05)，說明其對超聲波處理比較敏感。β-折疊含量呈先增加后降低的趨勢，而β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲含量有所增加。MP二級結(jié)構(gòu)組成中有序單元(α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu))的總含量也呈下降趨勢，表明超聲波處理時間越長，MP二級結(jié)構(gòu)改變的越多。β-折疊結(jié)構(gòu)易優(yōu)先轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角，本研究中β-轉(zhuǎn)角含量明顯增加，說明隨著超聲波處理的進行，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加松散[24]，MP分子中螺旋結(jié)構(gòu)部分展開，剛性結(jié)構(gòu)減少，柔性結(jié)構(gòu)增加，促使蛋白質(zhì)柔順性增強，這也可能是促使MP某些功能性質(zhì)(如溶解性、乳化性、起泡性等)改善的內(nèi)在因素。蛋白質(zhì)中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量增加，可能是由于α-螺旋逐漸解旋轉(zhuǎn)化，MP的構(gòu)象緊密性與穩(wěn)定性也因此大大降低。包埋于分子內(nèi)部的疏水性殘基暴露出來，增強了肌球蛋白分子間的疏水相互作用，引起蛋白質(zhì)的聚合[25]。

圖6 超聲波處理時間對肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)含量的影響

Fig.6 Effects of ultrasonic time on secondary structure content of myofibrillar protein

3 結(jié)論

經(jīng)適當(dāng)超聲波處理后的反復(fù)凍融雞肉肌原纖維蛋白，其溶解性、乳化性、起泡性及凝膠特性均得到顯著改善(P<0.05)。通過對MP粒徑的測定發(fā)現(xiàn)，超聲波的機械效應(yīng)和空穴效應(yīng)產(chǎn)生的強烈的振蕩作用及剪切力，使蛋白質(zhì)分子打開，顆粒分散和破碎，粒徑減小；與此同時，MP的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，巰基含量減少，被氧化為二硫鍵；通過對紫外光譜的測定也發(fā)現(xiàn)原本埋藏在分子內(nèi)部的生色基團暴露，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)改變；進一步測定紅外光譜表明，分子中α-螺旋和β-折疊都有所減少，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加松散。而隨著超聲波處理時間的延長，約超過12～15 min時，蛋白質(zhì)可能會發(fā)生變性，造成其再次聚集，顆粒變大，影響蛋白質(zhì)形成的致密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而通過凝膠電泳的測定，發(fā)現(xiàn)處理前后變化不明顯，說明超聲波對MP的修復(fù)作用與分子量的影響不大。