張琪，朱丹，牛廣財*，魏文毅，顏飛翔

1(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶，163319) 2(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶，163319)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科沙棘屬植物。沙棘果實中含有Vc、類胡蘿卜素、黃酮類化合物、多酚類化合物，以及豐富的不飽和脂肪酸、氨基酸等營養(yǎng)成分[1-3]，具有增強人體免疫力、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗輻射、預(yù)防心腦血管疾病以及美容護膚等作用[4-6]。我國是世界上沙棘屬植物類群分布最多的國家，沙棘總面積占世界的95%以上。將沙棘發(fā)酵成沙棘酒，是其精深加工的一個方向。目前對沙棘酒的研究多集中于其發(fā)酵過程中生物活性物質(zhì)變化和發(fā)酵工藝，如賀靜[7]研究了沙棘酒主發(fā)酵過程中不同處理條件下類胡蘿卜素、多酚及抗氧化性變化；牛廣財?shù)萚8]采用Folin-Ciocalteu比色法測定了沙棘酒中總多酚含量；蔡文超等[9]采用響應(yīng)面法優(yōu)化了沙棘酒的發(fā)酵工藝，在此工藝條件下，所發(fā)酵沙棘酒的酒精度為12.0% vol。但是，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)沙棘酒發(fā)酵過程中的酒精生成、基質(zhì)糖消耗及酵母菌體生長規(guī)律方面的研究。

發(fā)酵動力學(xué)是對微生物生長和產(chǎn)物形成過程的定量描述，研究發(fā)酵過程中菌體的生長、底物消耗和產(chǎn)物合成之間的動態(tài)平衡及內(nèi)在規(guī)律。胡永正對桑葚酒發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗和產(chǎn)物生成情況進行Logistic模型的非線性擬合，擬合效果較好，有利于其工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)[10]。通過相應(yīng)發(fā)酵動力學(xué)模型，可以對發(fā)酵過程進行定量分析和對實驗最終指標(biāo)進行預(yù)測。吳樹坤等采用SGompertz模型、DoseResp模型、Boltzmanm模型對不同發(fā)酵時間山葡萄發(fā)酵液中酵母生長期數(shù)量的變化、酒精生成情況及還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學(xué)模型，判定系數(shù)R2均大于0.995，能較好地描述發(fā)酵中的動力學(xué)特征[11]。

本試驗采用經(jīng)典的DoseResp模型、Boltzmann模型、SGompertz模型和Logistic模型，對沙棘果酒發(fā)酵過程中酵母生長期數(shù)量的變化、酒精生成和還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學(xué)模型，為沙棘果酒實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。同時，本試驗還測定了不同發(fā)酵時間沙棘果酒中總多酚、總黃酮和Vc含量，結(jié)合1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 法、總抗氧化能力試劑盒法測定不同發(fā)酵時間沙棘果酒抗氧化活性。通過對沙棘果酒發(fā)酵動力學(xué)和抗氧化活性研究，為沙棘果酒發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

冷凍沙棘果，深秋紅俄羅斯大果沙棘，總糖含量65.02 mg/mL，總酸含量17.82 g/L，pH值為3.0，購于黑龍江省孫吳縣大果沙棘展銷中心。RV171型葡萄酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；白砂糖，黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

Pectinex XXL果膠酶(酶活10 000 U/mL)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；沒食子酸標(biāo)準品、蘆丁標(biāo)準品、VC標(biāo)準品，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸，草酸，2,6-二氯靛酚鈉，NaOH，無水乙醇，Al(NO3)3，NaNO2，無水甲醇，福林酚，Na2CO3等，均為國產(chǎn)分析純；總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

WS108手持式折光儀，河北潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；HR7633打漿機，飛利浦家庭電器(珠海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計，上海凌析達儀器；L420臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YS100尼康生物顯微鏡，日本尼康公司；EX324電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 沙棘果酒發(fā)酵工藝流程與操作要點

工藝流程如下：

冷凍沙棘果→打漿→酶解→調(diào)整糖度→殺菌→接種→發(fā)酵→恒溫培養(yǎng)→沙棘果酒→分析測定

操作要點：

(1)將冷凍沙棘果在室溫下進行解凍后，用打漿機打漿，測其可溶性固形物的含量[12]。

(2)用果膠酶進行酶解，溫度為45～50 ℃，酶解時間是3 h[13]。

(3)加白砂糖調(diào)整糖度至21 °Brix[14]。

(4) 活化酵母菌：用1/3的沙棘汁和2/3的蒸餾水溶解干酵母，在35 ℃下將酵母菌活化30 min。

(5)接種前在60 ℃條件下殺菌30 min，然后冷卻至室溫，接入質(zhì)量濃度5 g/L活化好的酵母菌，于21 ℃條件下恒溫發(fā)酵。每24 h取樣1次，取發(fā)酵液離心后的上清液進行檢測，3次重復(fù)。

1.4 發(fā)酵動力學(xué)數(shù)據(jù)的測定

1.4.1 酵母菌數(shù)量測定

將發(fā)酵液取出用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，滴于血球計數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下直接計數(shù)。

1.4.2 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS)比色法測定還原糖的質(zhì)量濃度[15]。葡萄糖標(biāo)準曲線方程為：y=0.538 9x-0.016 1，R2=0.997 2。

1.4.3 酒精度測定

采用蒸餾法和密度瓶法測定沙棘果酒的酒精度數(shù)[16]。

1.5 總多酚、總黃酮與Vc含量的測定

1.5.1 總多酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定沙棘果酒中的總多酚的含量[17]。沒食子酸標(biāo)準曲線方程為：

y=0.179 2x+0.088 7，R2=0.998 6

根據(jù)標(biāo)準曲線及樣品吸光度，計算出發(fā)酵液總多酚的含量。

1.5.2 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定沙棘果酒中總黃酮的含量[18]。蘆丁標(biāo)準曲線方程為：

y=0.080 2x+0.004 7，R2=0.997 5

根據(jù)標(biāo)準曲線及樣品吸光度，計算出發(fā)酵液總黃酮的含量。

1.5.3 Vc含量的測定

采用2,6-二氯靛酚滴定法[19]。

1.6 抗氧化性測定

1.6.1 DPPH自由基清除能力測定

采用李治龍等[20]的方法略有改動。配制DPPH溶液：用電子天平稱取19.7 mg DPPH，然后用體積分數(shù)95%乙醇溶解后直接定容至100 mL，得到DPPH溶液，濃度為0.5 mmol/mL，配制好的溶液于0～4 ℃下避光保存。取2 mL稀釋后的樣液與0.5 mL DPPH溶液混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Ai；取2 mL無水甲醇與0.5 mL DPPH溶液混合，混合均勻后在37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Ac；取2 mL處理好的樣液與0.5 mL無水甲醇混合，混合均勻后37 ℃下黑暗處放置20 min，此時用無水甲醇為空白，在517 nm條件下測定其吸光度Aj。按照公式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：Ai，加發(fā)酵液反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度；Ac，加DPPH溶液，不加發(fā)酵液的吸光度；Aj，加發(fā)酵液，不加DPPH溶液的吸光度。

1.6.2 總抗氧化能力的測定

參考韋云路等的方法[21]，總抗氧化能力測定采用總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)測定試劑盒方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實驗進行3次重復(fù)，采用Origin 9.0軟件進行作圖分析，再選取適合的模型對酵母菌數(shù)量、酒精度以及還原糖含量進行非線性擬合。比較擬合相關(guān)系數(shù)，選取擬合度高的模型進行定量描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量、酒精度以及還原糖含量的變化

由圖1可知，酵母菌在24～96 h增長速度較快，為快速增長期，隨后數(shù)量變化幅度較大，進入穩(wěn)定期和衰亡期。到96 h左右時酵母菌數(shù)最高值達到7.8×108CFU/mL，96 h后，酵母菌數(shù)量逐漸減少，其原因是在較高酒精濃度和較低還原糖濃度下進入平穩(wěn)期而衰亡[22]，出現(xiàn)菌體自溶和沉淀。還原糖含量隨著發(fā)酵時間的增長而下降，0～192 h還原糖消耗速度較快，由酵母菌轉(zhuǎn)化為酒精，192 h后基本保持穩(wěn)定。酒精度數(shù)呈逐漸升高的趨勢，在0～192 h升高較快，192 h后增幅變緩，在264 h時酒精度達到最高，為11.7% vol。表明在沙棘汁發(fā)酵過程中，酒精的生成與還原糖的消耗是對應(yīng)的。

圖1 沙棘果酒發(fā)酵過程中酒精度、酵母菌數(shù)、還原糖含量變化規(guī)律

Fig.1 Changes of alcohol content, yeast count, and reducing sugar content during fermentation of sea buckthorn wine

2.2 沙棘果酒的發(fā)酵動力學(xué)模型

2.2.1 酵母菌數(shù)生長動力學(xué)模型

表1 酵母菌數(shù)的擬合方程及其相關(guān)系數(shù)

由圖1可知，酵母菌在96 h后開始進入衰亡期，因此，本研究擬對發(fā)酵0～120 h時期酵母菌生長情況進行非線性擬合(見表1)。對比SGompertz模型、DoseResp模型及Logistic模型的擬合相關(guān)系數(shù)，SGompertz模型對酵母菌生長情況擬合效果最好，相關(guān)系數(shù)R2為0.956 2。故選用SGompertz模型。

對沙棘果酒酵母菌數(shù)的生長情況進行擬合，得到擬合曲線如圖2所示。由圖2可知，酵母菌在沙棘果酒發(fā)酵24 h后生長速率開始提高，在96 h時菌體數(shù)量達到最高值。

圖2 SGompertz模型下酵母菌生長擬合曲線

Fig.2 Fitting curve of yeast growth in the SGompertz model

2.2.2 酒精生成動力學(xué)模型

如表2所示，得出3種模型的擬合相關(guān)系數(shù)分別是0.995 1、0.991 5、0.992 1，可知Boltzmann模型擬合的效果最佳，所以，最終選取Boltzmann模型為沙棘果酒發(fā)酵中酒精生成的擬合模型。圖3是Boltzmann模型的擬合曲線。

表2 酒精生成擬合方程及相關(guān)系數(shù)

圖3 Boltzmann模型下酒精生成擬合曲線

Fig.3 Fitting curve of alcohol formation in the Boltzmann model

由圖3可知，酒精度在192 h后趨于平緩，最大值為11.7% vol。

2.2.3 還原糖消耗動力學(xué)模型

由表3可知，對比Boltzmann模型、DoseResp模型與Logistic模型這3種模型的擬合相關(guān)系數(shù)，Boltzmann模型和DoseResp模型擬合效果最好，相關(guān)系數(shù)R2均為0.979 6。因此，選取Boltzmann模型和DoseResp模型來擬合沙棘果酒發(fā)酵過程中的還原糖消耗過程。

表3 還原糖消耗擬合方程及相關(guān)系數(shù)

圖4 Boltzmann模型下還原糖消耗擬合曲線

Fig.4 Fitting curve of reducing sugar consumption in the Boltzmann model

圖5 DoseResp模型下還原糖消耗擬合曲線

Fig.5 Fitting curve of reducing sugar consumption in the DoseResp model

由圖4和圖5可知，在216 h之前，還原糖的消耗較快，之后消耗量放緩。這與吳樹坤擬合模型一致[11]。

2.3 總多酚、總黃酮和Vc含量的變化

2.3.1 沙棘果酒發(fā)酵過程中總多酚含量的變化

由圖6可知，總多酚含量呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵時間在24～96 h為沙棘果酒最主要發(fā)酵階段，此時沙棘果酒的出汁量比較多，可能是酵母菌把復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)，使得總多酚含量升高，沙棘果酒的總多酚含量由初始的61.75 mg/mL增長為146.01 mg/mL。在96 h之后的發(fā)酵中，總多酚含量開始逐漸下降，可能酵母菌生長代謝過程中產(chǎn)生了一些次級代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致總多酚物質(zhì)發(fā)生氧化、聚合或沉淀等反應(yīng)，還可能是果酒利用總多酚物質(zhì)發(fā)生褐變反應(yīng)，造成總多酚含量下降。此結(jié)論與李雪等[14]關(guān)于仙人掌果酒發(fā)酵過程和于立梅等[22]在研究山竹酒發(fā)酵過程中的總多酚變化趨勢的結(jié)論一致。

圖6 沙棘果酒發(fā)酵過程中總多酚含量的變化

Fig.6 Changes of total polyphenols content during fermentation of sea buckthorn wine

2.3.2 沙棘果酒發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

由圖7可知，沙棘果酒發(fā)酵過程中總黃酮含量呈先上升后降低的趨勢。在24～72 h，總黃酮含量不斷上升，在72 h時達到了最高值(12.60 mg/mL)。其原因可能是隨著發(fā)酵的進行，沙棘果大量出汁，酒精度不斷增加，使得黃酮類物質(zhì)不斷浸出，有利于醪液中黃酮的提取，且浸泡時間延長，黃酮的溶解量也不斷增加。

圖7 沙棘果酒發(fā)酵過程中總黃酮含量的變化

Fig.7 Changes of total flavone content during fermentation of sea buckthorn wine

但是，在發(fā)酵后期，總黃酮含量呈下降趨勢，可能是由于沙棘果酒在發(fā)酵過程中，丙酮酸、乙醛等酵母釋放的次級代謝產(chǎn)物會與黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成一些大分子衍生物所致，還可能是發(fā)酵后期多酚自身分解及氧化導(dǎo)致多酚黃酮含量下降[23]。

2.3.3 沙棘果酒發(fā)酵過程中Vc含量的變化

由圖8可知，Vc含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，與總多酚含量的變化趨勢一致。當(dāng)發(fā)酵至96 h左右，Vc含量達到最大值，為27.47 mg/100 mL。可能酶解處理沙棘果使其細胞壁被破壞，內(nèi)容物流出以及隨著發(fā)酵時間的延長，乙醇含量增加，活性物質(zhì)增多，包括Vc含量升高。之后Vc含量開始逐漸降低，這可能是發(fā)酵后期Vc氧化和發(fā)生不同程度的降解所致。

圖8 沙棘果酒發(fā)酵過程中VC含量的變化

Fig.8 Changes of vitamin C content during fermentation of sea buckthorn wine

2.4 沙棘果酒發(fā)酵過程中抗氧化性的變化

2.4.1 沙棘果酒發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率變化

圖9 沙棘果酒發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

Fig.9 Changes of DPPH radical scavenging rate during fermentation of sea buckthorn wine

由圖9可知，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這是因為隨著發(fā)酵時間的不斷增加，自身的抗氧化物質(zhì)不斷浸出，總多酚含量逐漸增加[24]，F(xiàn)EREIDOON等認為酚類物質(zhì)很容易給出一個氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定，是其具有高自由基清除能力的主要原因[25]，這使得其對DPPH自由基清除率較強；在發(fā)酵72～120 h是發(fā)酵的較佳時期，是清除率較高階段。在72 h時，沙棘果酒對DPPH自由基清除率最大，達到了76.12%；在120 h之后，DPPH自由基清除率則呈下降趨勢，可能是在發(fā)酵的過程中，果酒中的多酚類物質(zhì)與Vc含量降低，從而導(dǎo)致DPPH自由基清除能力下降[26]。

2.4.2 發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化

由圖10可知，沙棘果酒在發(fā)酵過程中總抗氧化能力呈現(xiàn)先上升后降低趨勢，與DPPH自由基清除率的變化相似。在發(fā)酵120 h時，總抗氧化能力達到最大，為145.53 U/mL?？赡苁请S著總多酚和Vc含量的增加，提高了沙棘果酒的抗氧化能力[27]；在發(fā)酵120 h之后，由于活性成分含量的逐漸下降，最終導(dǎo)致其總抗氧化能力下降[28]。

圖10 沙棘果酒發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化

Fig.10 Changes of total antioxidant capacity during fermentation of sea buckthorn wine

3 結(jié)論

SGompertz模型、Boltzmann模型、DoseResp模型及Boltzmann模型能較好地對酵母菌生長、酒精生成和還原糖消耗進行非線性擬合，所選模型能較好地模擬沙棘果酒的發(fā)酵過程及描述其發(fā)酵動力學(xué)特征；沙棘果酒發(fā)酵過程中的總多酚含量、總黃酮含量、Vc含量、DPPH清除率以及總抗氧化能力均呈前期快速增加，后期逐漸下降的峰型變化趨勢，其最大值分別達到了146.01、12.60、27.47 mg/100 mL、76.12%和145.53 U/mL。