張麗霞，周露玙，許 勝，王 濤，劉 靖，王 昆

心肌肥大是心臟對多種病理生理刺激的重要補償反應(yīng)，如心肌梗死，高血壓，瓣膜功能不全和收縮蛋白突變[1]。雖然在早期階段作為有益的適應(yīng)性反應(yīng)，但如果不進(jìn)行治療則由于失代償而逐漸惡化為心力衰竭。盡管已經(jīng)鑒定出參與心肌肥大過程的許多信號傳導(dǎo)途徑[2-3]，但是對于心肌肥大的潛在分子機制仍然知之甚少，這妨礙了臨床實踐中對這種心臟病的有效治療。因此非常希望揭開調(diào)節(jié)心肌肥大的新分子，從而破譯心肌肥大的新機制并制定治療該疾病的新策略。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，通過降解靶mRNA或直接翻譯抑制來沉默其同源靶基因[4]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在心肌肥大的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5]。例如，我們之前的研究結(jié)果表明miR-9[6]和miR-489[7]可以抑制心肌肥大，而miR-23a[8]是一種促進(jìn)心肌肥大的miRNA。其他研究如miR-133的下調(diào)導(dǎo)致顯著的心肌肥大[9]。另一方面，單獨過表達(dá)miR-208a，miR-195，miR-214，miR-24或miR-23a也已顯示在動物和培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中誘導(dǎo)肥大反應(yīng)[10]。顯然，miRNA在心肌肥大的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著多種重要作用。MiR-153參與多種疾病的生理過程，如胃癌[11]，乳腺癌[12-13]，宮頸癌[14]，神經(jīng)膠質(zhì)瘤[15]，骨肉瘤[16]等。并且miR-153-3p被認(rèn)為是一種新的生物靶標(biāo)[17]，然而其在心肌肥大的作用機制尚未可知，本研究以體外分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞為研究對象，利用異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)法建立心肌肥大的體外細(xì)胞研究模型，通過轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir(RNA拮抗劑)研究miR-153-3p在心肌肥大中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生0～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK-(魯)-2014-0007]。

1.1.2 主要試劑 ISO(上海樊克生物科技有限公司)；FITC Phalloidin FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)；RR820A takara SYBR?Premix ExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)(日本TaKaRa公司)；DEME培養(yǎng)基(英國Gibico公司)；胎牛血清(英國Gibico公司)；胰蛋白酶和II型膠原酶(日本TaKaRa公司)；TRIzol試劑盒(日本TaKaRa公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；lipofectamineTM 3000(美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 用75%酒精浸泡出生0～3 d的SD大鼠乳鼠，消毒2～3次，于滅菌超凈臺中用眼科剪取出心臟的心尖大部分，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗2～3遍直至無血細(xì)胞殘留，之后用剪刀剪碎至無大組織殘留，使用胰蛋白酶(10 mg/mL)和II型膠原酶(30 mg/mL)消化法反復(fù)消化，每次消化5～6 min后將細(xì)胞懸液吸出放入2%的胎牛血清中終止消化，最后將消化后的細(xì)胞懸液以800～1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，2次，通過細(xì)胞篩除去組織碎片，所提取的細(xì)胞置于含5%胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)基中，混勻細(xì)胞，種于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)皿中，采用差速貼壁1.5～2 h分離細(xì)胞，纖維細(xì)胞將貼壁生長，輕輕吸取含未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，按(0.5～1)×105/mL密度種植細(xì)胞于6孔板中或按(1.5～2)×107/mL密度種植于24孔板中，24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行實驗。

1.2.2 ISO誘導(dǎo)心肌肥大實驗 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞換液后，選擇6孔板中生長狀態(tài)良好的乳鼠心肌細(xì)胞用不同時間[0(對照組)、8、12、18、24、48 h]梯度的ISO(濃度為10 μmol/L)，并將培養(yǎng)基換為2%胎牛血清培養(yǎng)。在同一時間點收集細(xì)胞的RNA用熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)，β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)和miR-153-3p的表達(dá)。收集ISO誘導(dǎo)24 h的細(xì)胞進(jìn)行表面積染色，拍照后使用Image J軟件分別測量實驗組和對照組細(xì)胞大小。

1.2.3 MiR-153-3p拮抗實驗 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞換液后，選擇6孔板中生長狀態(tài)良好的乳鼠心肌細(xì)胞用lipofectamine 3000將miR-153-3p的拮抗劑(antagomir)和NC(陰性對照)轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4 h后換液加入ISO miR-153-3p，分組如下：0 h(空白組)，ISO組(藥物誘導(dǎo)組)，ISO+NC組(陰性對照組)，ISO+miR-153-3p antagomir組(實驗處理組)。24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行表面積染色，拍照后使用Image J軟件分別測量實驗處理組和陰性對照組細(xì)胞大小，并收集細(xì)胞的RNA行RT-qPCR法檢測ANP，β-MHC和miR-153-3p基因表達(dá)。

1.2.4 RT-qPCR 用RT-qPCR法檢測。使用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，而后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，用隨機引物合成cDNA，或加入莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄miR-153-3p，用SYBR Green熒光RT-PCR法檢測反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中心肌肥大標(biāo)志基因ANP，β-MHC的mRNA表達(dá)和miR-153-3p的表達(dá)。上述實驗均重復(fù)3次。RT-qPCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5 表面積染色 將上述提取的細(xì)胞按(1.5～2)×107/mL密度種植于24孔板中，按下述步驟進(jìn)行染色：①在24孔板中加入賴氨酸包被的蓋玻片，按孔調(diào)整細(xì)胞濃度；②將要染色的細(xì)胞用PBS洗2遍，加入0.5～1 mL 3.7%的多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫15 min，用PBS充分洗滌；③用丙酮脫水5 min，用含有0.2% Triton X-100的PBS配制TRITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(TRITC-Phalloidin)，錫紙避光，室溫，染40 min；④用PBS洗3次，以去掉未反應(yīng)的染料；⑤將貼有細(xì)胞一面的蓋玻片扣于含DAPI封片液的蓋玻片上。

2 結(jié)果

2.1 ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大情況 與對照組比較，隨著ISO的誘導(dǎo)時間越長心肌細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)肥大效果，在ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞18 h和24 h后，ANP和β-MHC基因的表達(dá)具有顯著差異，尤其在24 h誘導(dǎo)肥大效果更加明顯(圖1A、B，P<0.05),48 h后心肌細(xì)胞肥大降低，可能是由于細(xì)胞凋亡引起。對ISO誘導(dǎo)24 h的心肌細(xì)胞進(jìn)行表面積染色發(fā)現(xiàn)與對照組比較，實驗組心肌細(xì)胞的表面積顯著增加(圖2，P<0.05)。

2.2 MiR-153-3p在心肌肥大細(xì)胞中的表達(dá)情況 與對照組比較，隨著ISO的誘導(dǎo)時間越長miR-153-3p的表達(dá)逐步升高，在ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞18 h和24 h后miR-153-3p基因的表達(dá)具有顯著差異，尤其在24 h上升更加明顯(圖3，P<0.05)。這與上述的心肌細(xì)胞肥大驗證結(jié)果相一致，表明miR-153-3p可能促進(jìn)心肌肥大。

n=3；與對照組相比，*P<0.05圖1 不同時間梯度ISO處理組ANP(A)和β-MHC(B)的表達(dá)情況

n=3；與對照組相比，*P<0.05圖2 ISO誘導(dǎo)24 h后心肌細(xì)胞表面積的變化情況

n=3；與對照組相比， *P<0.05圖3 不同時間梯度ISO處理組miR-153-3p的表達(dá)情況

2.3 MiR-153-3p拮抗實驗后對心肌肥大的影響 轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir 4 h后行RT-qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-153-3p的表達(dá)降低(圖4，P<0.05)，表明miR-153-3p拮抗成功，進(jìn)一步行RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與ISO組和ISO+NC組比較，ISO+antagomir組的心肌細(xì)胞肥大效果顯著降低(圖5A、B，P<0.05)。心肌細(xì)胞表面積的結(jié)果也同這一結(jié)果相一致(圖6，P<0.05)，進(jìn)一步證明miR-153-3p促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。

ISO組：ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+NC組：先轉(zhuǎn)染NC 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+miR-153-3p antagomir組：先轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；n=3；與陰性對照組比較，*P<0.05圖4 轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir后的敲低情況

ISO組：ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+NC組：先轉(zhuǎn)染NC 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+miR-153-3p antagomir組：先轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；n=3；與陰性對照組比較，*P<0.05圖5 轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir后ANP(A)和β-MHC(B)的表達(dá)情況

ISO組：ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+NC組：先轉(zhuǎn)染NC 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；ISO+miR-153-3p antagomir組：先轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir 4 h后用ISO誘導(dǎo)24 h；n=3；與陰性對照組比較，*P<0.05圖6 轉(zhuǎn)染miR-153-3p antagomir后心肌細(xì)胞表面積的變化情況

3 討論

心肌肥大是由于神經(jīng)體液活化引起的應(yīng)激增加和血流動力學(xué)負(fù)荷增加而發(fā)生的，通常會發(fā)展為心力衰竭，死亡率高。最初，心臟經(jīng)歷適應(yīng)性形態(tài)學(xué)變化，導(dǎo)致補償性肥大以維持心輸出量。持續(xù)性肥大是不可逆轉(zhuǎn)的，并且在長期壓力下不可避免地導(dǎo)致失代償性心力衰竭，引起患者的死亡[18]。

在神經(jīng)體液因素中，ISO受體及其信號傳導(dǎo)通路是誘導(dǎo)心肌肥大的重要因素。該通路一旦被激活，會改變細(xì)胞內(nèi)多個基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)量，發(fā)生一些列生物化學(xué)變化，從而導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生。在本研究中，采用了ANP和β-MHC基因作為心肌肥大的發(fā)生指標(biāo)，二者均是與細(xì)胞肥大密切相關(guān)的基因，在心臟胚胎發(fā)育早期或出生后病理狀態(tài)下高表達(dá)，新出生0～3 d SD大鼠心肌細(xì)胞在體外可以離體培養(yǎng)7 d，是研究心臟相關(guān)疾病的經(jīng)典模型[19]。

miRNA屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，主要通過作為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體的一個元件，識別mRNA的3′端非編碼區(qū)，引起該mRNA降解或者翻譯抑制，從而負(fù)性調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)，發(fā)揮其生物學(xué)功能。許多miRNAs已被證實是心血管疾病治療的目標(biāo)基因,如miRNA23、miRNA24、miRNA199、miRNA98等[20]。MiR-153-3p可以通過多種信號通路參與疾病的發(fā)生，如與lncRNAs HIF1A-AS2相互作用促進(jìn)HIF-1α的上調(diào)，從而促進(jìn)缺氧時人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成[21]；circRNA_0084043可以通過miR-153-3p/Snail軸促進(jìn)惡性黑素瘤進(jìn)展[22]；miRNA-153-3p還可以通過靶向黑色素瘤中的SNAI1來抑制細(xì)胞增殖和侵襲[23]。本研究通過檢測ISO誘導(dǎo)的心肌肥大中的miR-153-3p基因的表達(dá)水平，以及檢測敲低miR-153-3p對ISO誘導(dǎo)的心肌肥大效果的影響，mRNA水平與表面積結(jié)果都顯示miR-153-3p可能促進(jìn)由ISO誘導(dǎo)的心肌肥大。因此，我們的研究結(jié)果揭示了miRNA在控制心肌肥大發(fā)展中的新信號機制。

考慮到miR-153-3p能夠通過多種信號通路參與疾病的發(fā)生，并且miRNA屬于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，其作用機制主要是通過它對相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控實現(xiàn)的，在本研究的基礎(chǔ)上，尋找miRNA的靶基因從而研究它們之間的相互作用機制及相關(guān)靶基因?qū)π募》蚀蟮淖饔茫瑢檫M(jìn)一步明確miRNA的作用機制，闡明心肌肥大的相關(guān)生理、病理過程發(fā)生、發(fā)展機制起到重要的促進(jìn)作用[24]。