王文第 毛寶宏 王晶晶 劉月芬 王 劍 王燕俠

淋巴細胞是人體免疫系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分。許多免疫相關(guān)的兒科疾病的診斷與治療都涉及淋巴細胞亞群的檢測。但是，目前國際上尚無兒童淋巴細胞亞群參考區(qū)間的統(tǒng)一標準，國內(nèi)多數(shù)實驗室均采用國外試劑說明書或國外參考文獻提供的參考范圍出具報告單[1,2]。許多研究表明，淋巴細胞亞群的參考值與被檢測者的年齡、性別、民族和地區(qū)等因素相關(guān)[3-7]。因此，使用國外的淋巴細胞亞群參考值范圍對我國兒童疾病狀態(tài)下的免疫功能進行評估，可能造成一定偏差，有必要建立本地兒童分年齡段和性別相應的參考范圍。本研究旨在通過流式細胞術(shù)建立甘肅地區(qū)學齡前健康兒童淋巴細胞亞群的正常參考范圍，為臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 倫理 本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院(我院)倫理委員會審核通過(2017院倫審研第14號)。

1.2 納入標準 ①2018年1月31日至2019年1月30日在我院行鞘膜積液、疝、血管瘤等手術(shù)(疾病類型均對機體免疫功能影響不大)或常規(guī)體檢的0～7歲漢族健康兒童；②家長同意參加本研究并簽署知情同意書。

1.3 排除和剔除標準 ①患心腦血管疾?。和ㄟ^病史描述(如是否有頭痛、頭暈、心悸、氣短、無力等癥狀)判斷。②血常規(guī)異常：通過血常規(guī)報告判斷。③肝、腎功能異常：手術(shù)患兒通過肝、腎功能檢查報告判斷；健康體檢兒童部分有肝、腎功能報告，部分通過門診醫(yī)師工作站中的病史描述判斷。④在進行淋巴細胞亞群檢測的3周內(nèi)存在感染：通過病史描述和血常規(guī)WBC判斷。⑤有先天性免疫缺陷疾?。焊鶕?jù)淋巴細胞亞群檢測結(jié)果，剔除淋巴細胞亞群明顯異常及不符合公式T%+B%+NK%=100%±5%和Th%+Ts%=T%±5%的樣本。

1.4 年齡分組 參考文獻[8]，分為新生兒組、嬰兒組、幼兒組和學齡前組。

1.5 淋巴細胞亞群檢測方法 手術(shù)患兒在術(shù)前檢查或術(shù)后復查時采集血液樣本，體檢兒童在體檢時采集血液樣本。采靜脈血2 mL(EDTA抗凝)，于24 h內(nèi)完成檢測。 采用四色免洗試劑MultiTestTMIMK Kit和FACSCalibur流式細胞儀(均為美國BD公司產(chǎn)品)，按照試劑說明書進行檢測。每個全血標本標記2支流式細胞儀專用試管，分別加入20 μL MultiTest CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC和20 μL MultiTest CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC于試管底部；將100 μL EDTA-K2抗凝全血加入各管底部，充分震蕩混合，避光孵育30 min；向各管中加入500 μL MultiTest溶血素(1×)，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min；加入PBS 1 mL，離心5 min，棄上清；加入PBS 500 μL，混勻后上機。使用MultiSET軟件自動獲取淋巴細胞亞群相對計數(shù)結(jié)果。

1.6 質(zhì)量控制 ①我院實驗室使用的流式細胞儀通過國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價；②每次樣品檢測前使用BD公司專用四色熒光校準微球進行儀器校準；③所有檢測由同一位檢驗師完成，數(shù)據(jù)分析由王文第和毛寶宏共同完成。

1.7 統(tǒng)計學方法 非正態(tài)分布變量，用百分位數(shù)法(P2.5、P50、P97.5)獲得正常參考值的范圍，多組間比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩組比較用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 圖1顯示，研究對象篩選流程，792名0～7歲漢族兒童進入本文分析，男472名，女320名，新生兒組174名、嬰兒組216名、幼兒組170名、學齡前組232名，來源手術(shù)人群623例，健康體檢人群169例(表1)。

圖1 研究對象篩選流程圖

表1 792名甘肅漢族兒童的一般情況

2.2 外周血淋巴細胞亞群在不同性別、不同年齡組兒童之間的比較 表2顯示，①不同性別之間比較，新生兒組CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞、NK細胞百分比和CD4+/CD8+比值差異有統(tǒng)計學意義，嬰兒組CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞百分比和CD4+/CD8+比值差異有統(tǒng)計學意義；學齡前組T細胞、CD4+T細胞、B細胞、NK細胞百分比差異有統(tǒng)計學意義；②男、女各年齡組組間整體比較，T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞百分比，CD4+/CD8+差異均有統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 792名甘肅省漢族兒童外周血淋巴細胞亞群分布[中位數(shù)(P2.5，P97.5)]

2.3 外周血淋巴細胞亞群在各年齡組的分布趨勢 圖2顯示，隨著年齡的增加，男女兒童淋巴細胞亞群百分比整體的變化趨勢不同。T細胞、CD4+T細胞百分比隨年齡增長呈降低趨勢，男女童降低趨勢相近；CD8+T細胞百分比隨年齡增長呈升高趨勢，女童更明顯；B細胞百分比在1歲前呈上升趨勢，之后呈降低趨勢，女童的變化趨勢較為緩和；NK細胞百分比的變化與B細胞相反，在1歲內(nèi)降低，而后升高，男童變化趨勢更明顯。

圖2 男女兒童各年齡組淋巴細胞亞群百分比變化趨勢

3 討論

國內(nèi)外對于健康成年人淋巴細胞亞群的研究表明，淋巴細胞亞群檢測結(jié)果存在年齡、性別、民族和地域的差異[1,14,15]。由于兒童的免疫系統(tǒng)是逐漸成熟的過程，淋巴細胞亞群計數(shù)在兒童不同生長發(fā)育階段會表現(xiàn)出一定的差異[16]。

本研究結(jié)果顯示，各年齡段多項淋巴細胞亞群指標存在性別差異。這與肖婧等[6]研究中592名中國漢族健康兒童(28 d至12 歲)外周血淋巴細胞亞群的分布特點類似。本研究CD4+、B細胞百分比在各年齡組間均女童高于男童，與林珊等[5]研究結(jié)果相反。淋巴細胞亞群在男女性別間產(chǎn)生差異可能是由于基因遺傳和內(nèi)分泌的不同導致不同性別可在童年時期形成不同的免疫力。本研究男女兒童各年齡組間分析顯示，總體上所有淋巴細胞亞群在各年齡組之間的差異有統(tǒng)計學意義，男女兒童淋巴細胞亞群在多個年齡組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義，這與林珊等[5]、肖婧等[6]研究結(jié)果一致；新生兒組T細胞、CD4+百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于其他組，與林珊等[5]的研究結(jié)果一致；且新生兒期以后各年齡段T細胞百分比相對穩(wěn)定，與Kam等[12]和肖婧等[6]的研究結(jié)果一致。由于新生兒自身免疫功能尚未發(fā)育完全的生理特點，本研究分析了174例新生兒的淋巴細胞亞群百分比，與肖婧等[6]的研究不同。本研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細胞、CD4+/CD8+比值隨年齡增長呈降低趨勢，CD8+T細胞隨年齡增長呈升高趨勢，與大多數(shù)國內(nèi)外研究一致；B細胞在1歲前升高，而后降低，NK細胞變化趨勢恰好與B細胞相反，這與Kam等[12]和林珊等[5]的研究結(jié)果一致。

圖3顯示，本文結(jié)果與美洲[1]、歐洲[10]、非洲[11]和中國香港[12]比較兒童淋巴細胞亞群百分比、隨年齡段的變化趨勢基本一致，數(shù)值存在一定差異。與美洲[1]、歐洲[10]和非洲[11]兒童相比，甘肅漢族兒童T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞百分比較高，B細胞百分比較低，表明種族影響淋巴細胞亞群分布。與中國香港[12]兒童相比，甘肅地區(qū)的漢族兒童CD4+T細胞百分比較高，CD8+T細胞和NK細胞百分比較低，顯示同一國家不同區(qū)域的淋巴細胞亞群亦存在差異，這可能與環(huán)境和生活習慣等因素有關(guān)。

圖3 不同人群淋巴細胞亞群百分比隨年齡增長變化趨勢

注 w：周；m：月；y：歲

因此，不同地區(qū)應建立各自各年齡組及性別組的參考值。但是，由于兒童志愿者的招募及標本采集較為困難，使用流式細胞術(shù)來確定參考范圍需要較大的成本消耗，使得我國對健康兒童不同年齡段以及不同性別的外周血淋巴細胞亞群的研究較少，只有少數(shù)的實驗室建立了參考值[6,15,17，19]，絕大多數(shù)實驗室都通過國外的有關(guān)文獻以及試劑說明書來確定其參考范圍，這些參考值可能并不適合我國不同省份兒童。另外，本研究檢測了174例新生兒血樣標本分析淋巴細胞亞群，檢測數(shù)據(jù)可為新生兒淋巴細胞亞群百分比的評估提供參考。文獻[20]指出，淋巴細胞亞群結(jié)果應首先根據(jù)下述公式進行評估：T細胞(%)+B細胞(%)+NK細胞(%)=100%；CD4+T細胞(%)+CD8+T細胞(%)=T細胞(%)。本研究所得出參考值的中位數(shù)符合上述公式，證實了研究結(jié)果符合各淋巴細胞亞群保持一定比例的規(guī)律。

本研究的不足：確定醫(yī)學參考值范圍的樣本量如果性別間可能有差別，不同性別的樣本量應至少達到100例，本文女生組中樣本量不足。