黃備，邵君波，母清林

浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，浙江 舟山 316021

海洋沉積物是地球上面積最大的覆蓋層，約為3.5×108km2，覆蓋地球面積的48.6%，是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是地球上最復(fù)雜的微生物棲息地。據(jù)估計(jì)，海底沉積物中的原核生物生物量占全球原核生物生物量的 1/2－5/6，占全球生物總生物量的 1/10－1/3（李濤等，2008）。海洋環(huán)境中絕大多數(shù)微生物都是處于未可培養(yǎng)的狀態(tài)，影響了對(duì)環(huán)境微生物的深入研究（Arakaki et al.，2010）。在眾多的微生物中只有不到 1%的微生物能夠通過培養(yǎng)的方法分離出來（Gans et al.，2005）。因此，這種傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法只能作為一種輔助工具，需要結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)方法才能更客觀而全面地反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。

隨著近幾年分子生物學(xué)技術(shù)的普及，從 DNA水平研究微生物的多樣性已成為當(dāng)前研究最主要的技術(shù)手段，并推動(dòng)了微生物海洋學(xué)的快速發(fā)展（Venter et al.，2004）。近年來關(guān)于陸架沉積物微生物的研究成為新的熱點(diǎn)領(lǐng)域，眾多國內(nèi)學(xué)者針對(duì)不同區(qū)域的海洋沉積物，分別采用不同的分子生物學(xué)技術(shù)手段開展了研究（Valentina et al.，2018；張東聲，2011；杜萍等，2012；王健鑫等，2012；何建瑜等，2013；有小娟等，2013；劉明華等，2015）。

作為西太平洋重要的邊緣海，黃海位于中國大陸與朝鮮半島之間，是一個(gè)半封閉的海盆。黃海在全球碳循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)中起著重要的作用。黃海不僅受到黑潮、東亞季風(fēng)以及ENSO現(xiàn)象等多種自然氣候條件的影響，而且黃海的陸源輸入受到長江和黃河的控制，人類活動(dòng)對(duì)長江和黃河的影響也必將給黃海的生態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。因此，黃海是研究海洋生態(tài)系統(tǒng)演變及其對(duì)氣候變化和人類活動(dòng)響應(yīng)的理想場所。已有研究表明，黃海的海洋生態(tài)系統(tǒng)在近幾十年發(fā)生了很大的變化。由于農(nóng)業(yè)施肥，環(huán)境污染，過度捕撈等人類活動(dòng)的影響，黃海生物多樣性減?。▌⑷鹩?，2004）。近年來不少學(xué)者從不同角度對(duì)黃海微生物群落開展了調(diào)查研究。Zhao et al.（2010）對(duì)黃海和東海海域的異養(yǎng)菌數(shù)量和初級(jí)生產(chǎn)力進(jìn)行了調(diào)查研究，Meng et al.（2011）對(duì)黃海西部海域 48個(gè)測點(diǎn)的底棲細(xì)菌、底棲藻類和微型動(dòng)物的數(shù)量分布及相互關(guān)系進(jìn)行了研究。然而應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段對(duì)黃海沉積物微生物群落組成進(jìn)行深入調(diào)查，并結(jié)合沉積物環(huán)境因子進(jìn)行分析研究的相關(guān)報(bào)道還未曾見到。

本文采用基于Illumina成熟的TruSeq邊合成邊測序技術(shù)的MiSeq高通量測序平臺(tái)對(duì)各站位環(huán)境微生物多樣性進(jìn)行了全面深入的調(diào)查。并應(yīng)用多種統(tǒng)計(jì)軟件等常用群落分析工具，對(duì)黃海西部海域微生物群落與環(huán)境因子，特別是典型污染物之間的潛在聯(lián)系進(jìn)行了深入研究。分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和空間差異，發(fā)掘與環(huán)境的潛在聯(lián)系，以期為我國黃海沿海地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展與環(huán)境管理提供技術(shù)支撐。

1 研究方法

1.1 樣品采集

在黃海西部海域（124°E以西），設(shè)置了19個(gè)海域生態(tài)監(jiān)測站位，按緯度從北到南分成A、B、C、和D 4組，每組呈水平分布，各組間隔約緯度1°（圖1）。2016年10月利用專業(yè)海洋調(diào)查船“浙海環(huán)監(jiān)”號(hào)，用靜力式采泥器采集各站位沉積物。取表層（5 cm層）泥樣于滅菌的10 mL凍存管中，-80 ℃冷凍保存并帶回實(shí)驗(yàn)室。

圖1 黃海西部海域采樣站位示意圖Fig. 1 Sampling sites in the west Yellow Sea

1.2 總DNA提取、測序及序列分析

各站位樣品總DNA采用TIANGEN TIANamp Soil DNA Kit試劑盒提取，按標(biāo)準(zhǔn)流程操作。測序樣品交由杭州晶佰生物科技有限公司按照16S宏基因組測序標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建環(huán)境微生物16S rRNA基因V3－V4可變區(qū)（引物序列：341F-CCTACGGGNGG CWGCAG；805R-GACTACHVGGGTATCTAATCC）測序文庫并進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，應(yīng)用 Illumina MiSeq雙末端（250 bp×2）測序平臺(tái)完成序列測定。測序數(shù)據(jù)分析、質(zhì)量控制及相應(yīng)的生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析參考相關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行（黃備等，2018）。

1.3 海域底質(zhì)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測

海域底質(zhì)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測內(nèi)容包：粒度、石油類、汞、砷、銅、鎘、鉛、鋅、鉻、有機(jī)碳、總氮、總磷、多氯聯(lián)笨、多環(huán)芳烴、底棲生物生物量和密度。監(jiān)測采樣和分析方法按《海洋監(jiān)測規(guī)范》（GB17378—2007）和《海洋調(diào)查規(guī)范》（GB12763—2007）進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 海域環(huán)境因子

按1.3描述的方法開展研究海域環(huán)境調(diào)查，其中幾項(xiàng)主要因子監(jiān)測結(jié)果如表1。

表1 主要環(huán)境因子監(jiān)測結(jié)果Table 1 Results of main environmental factors

研究海域沉積物環(huán)境因子（粒徑、總氮、總磷和總有機(jī)碳）的平面分布如圖2所示。黃海西部海域沉積物粒徑在中央形成明顯的細(xì)顆粒區(qū)，四周離大陸較近的海域沉積物粒徑較粗。由于細(xì)小顆粒的吸附作用，總氮和 TOC在中央海域形成高值區(qū)，沿海海域?yàn)榈椭祬^(qū)。而總磷受沿岸入海排放的影響，在鄰近長江口和山東半島的沿海區(qū)域形成兩個(gè)高值區(qū)，在中央海域是總氮的低值區(qū)。

黃海西部海域沉積物中多種重金屬和有機(jī)物的分布圖3所示。受沉積物粒徑分布的影響，多種重金屬和有機(jī)物均在黃海中央形成高值區(qū)，不過鎘和汞在研究海域北部（鄰近山東半島）分別也形成了一個(gè)相對(duì)高值區(qū)，砷和錳在研究海域西側(cè)（鄰近江蘇沿海）分別形成了另一個(gè)高值區(qū)。

沉積物中微生物 OTU數(shù)量和底棲生物數(shù)量分布如圖4所示。OTU數(shù)量與底棲生物量分布較為相似，均在黃海中央偏南海域形成了高值區(qū)，而底棲生物密度在黃海西部和北部海域形成了高值區(qū)，東南海域數(shù)量較低。

2.2 海域沉積物微生物群落

2.2.1 序列統(tǒng)計(jì)

本研究共獲得黃海西部海域 19個(gè)站位沉積物的微生物原始序列701885對(duì)（pair-end reads），站位間序列數(shù)介于35200－38866條之間，序列平均長度為422 bp。經(jīng)質(zhì)量控制和序列優(yōu)化，篩選出高質(zhì)量序列661532條。原始序列通過預(yù)處理，按97%序列相似度進(jìn)行劃分，共得到 10925個(gè)OTU，其詳細(xì)分布見表2。

應(yīng)用 Mothur軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們的Chao1指數(shù)構(gòu)建稀釋曲線如圖5所示。結(jié)果顯示，各站位曲線均趨向平坦，說明本實(shí)驗(yàn)測序數(shù)量合理，OTU取樣已達(dá)到或接近飽和，實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本反映了樣品的物種多樣性。

2.2.2 微生物種類組成

本研究在黃海西部海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共41門250科442屬。從門水平上看，變形菌門（Proteobacteria）在各站位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其相對(duì)豐度占總數(shù)的47%。其它較為豐富的門類包括酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes），浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。各站位門類組成詳見圖 6。從屬水平上看，Gammar變形菌在各站位中均是最主要的優(yōu)勢菌，其它主要種類還有Delta變形菌、擬桿菌（Bacteroides）、黏球菌屬（Myxococcus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、浮霉菌屬（Planctomycetes）和疣微菌屬（Verrucomicrobium）等。各站位主要種屬組成詳見圖7。

圖4 黃海沉積物中OUT豐度和底棲生物生物量分布Fig. 4 Distribution of microbial OUT abundance and benthos biomass in the west Yellow Sea

表2 海域沉積物微生物序列信息統(tǒng)計(jì)Table 2 Summary of marine sediment microbial sequences

圖5 海域沉積物微生物稀釋曲線Fig. 5 Rarefaction curves of marine sediment microbes

本文各監(jiān)測斷面呈平行的南北分布，應(yīng)用屬水平的Venn-Diagram圖分析各測線微生物群落的差異（圖8）?？傮w上各測線微生物群落比較相似，共有物種占一半以上，共有248個(gè)屬。4個(gè)組均有少數(shù)各自特有的物種，其中B組的特有物種最多，共有23屬，其次為D組（17屬）和C組（8屬），A組（4屬）相對(duì)較少。

圖6 海域沉積物微生物種類組成（門水平）Fig. 6 Composition of marine sediment microbes (phylum level)

圖7 海域沉積物微生物種類組成（屬水平）Fig. 7 Composition of marine sediment microbes (genus level)

通過分類樹熱圖來反映研究海域微生物群落組成和物種豐度，圖內(nèi)層是物種分類樹，橙色小球表示在各組樣品中存在明顯差異。在分類樹的末端，采用熱圖的方法，表示樣品豐度的大小，顏色越深，豐度越大。如圖9所示，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和疣微菌門組成了研究海域絕大多數(shù)的微生物群落。豐度熱圖顯示各組樣品中高豐度微生物組成基本一致，但也有個(gè)別例外，如脫硫桿菌（Desulfobulbus）、除硫單胞菌（Desulfuromonadaceae）和火色桿菌（Flammeovirgaceae）的豐度在D組中明顯高于其它組；紫單胞菌（Porphyromonadaceae），乳桿菌（Lactobacillus），紅小梨形菌（Rhodopirellula）和Dasania在A組中的豐度明顯高于其余樣品中。

2.2.3 微生物多樣性

圖8 海域沉積物微生物群落差異分析（屬水平）Fig. 8 Differential analysis on sediment microbial community(genus level)

表3 海域沉積物微生物多樣性指數(shù)Table 3 Biodiversity indices of marine sediment microbes

本研究采用Mothur軟件，按97%序列相似水平計(jì)算Chao1、Shannon和Simpson多樣性指數(shù)，并根據(jù)Coverage計(jì)算結(jié)果評(píng)估測序深度（表 3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各站位總體菌群豐度指數(shù)Chao1指數(shù)較高，均值為7365.3，站位間有一定的差異。而反映菌群多樣性的 Shannon指數(shù)平均為 9.65，Simpson指數(shù)平均為 0.995，顯示出各站微生物多樣性非常高，且站位間差異較大。各站位測序深度指數(shù)coverage平均為 0.9，說明各樣品文庫的覆蓋率較高，樣本中序列沒有被測出的概率極低，進(jìn)一步證實(shí)了稀釋曲線的結(jié)論。

圖9 微生物豐度分類樹熱圖Fig. 9 Taxonomic comparison of microbial abundance by heatmap

PCA分析（Principal Component Analysis），即主成分分析，通過分析不同樣品 OTU組成可以反映樣品間的差異和距離。從圖 10可知，研究海域西側(cè)的D5－D9、A5、B8和C9這幾個(gè)測點(diǎn)微生物群落比較接近，另外B5－B7微生物群落也非常相似，其余各測點(diǎn)差異相對(duì)較大。

圖10 海 域沉積物微生物群落PCA圖（屬水平）Fig. 10 Principal Component Analysis of sediment microbial community(genus level)

2.3 對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)

為了直觀反映沉積物微生物與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系，本研究應(yīng)用Past軟件，采用CCA分析法進(jìn)行排序。通過微生物門類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在 CCA排序圖中，第一軸和第二軸分別解釋了總變異的48%和20.4%（圖11），這表明本研究開展的環(huán)境因子在較大程度上能夠解釋沉積物微生物群落的變異。圖中圓點(diǎn)代表微生物門類，射線代表環(huán)境因子。環(huán)境因子的射線越長，表明該因子對(duì)研究對(duì)象的影響程度越大；而微生物到環(huán)境因子垂直距離的長短決定了兩者之間的相關(guān)性大小，距離越短相關(guān)性越大，距離越長相關(guān)性越小。從圖中可知，總磷和沉積物粒徑對(duì)微生物門水平的群落分布具有顯著性影響。

通過計(jì)算微生物門類組成與環(huán)境因子間Pearson相關(guān)系數(shù)并繪制熱圖分析，發(fā)現(xiàn)了總磷、粒徑、總氮和 TOC等與一些微生物門類的組成和分布呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系（圖 12）。結(jié)果顯示，酸桿菌、衣原體（Chlamydiae）和硝化螺旋菌（Nitrospirae）與總磷呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；黏膠球形菌（Lentisphaerae）與銅、鋅、多環(huán)芳烴、總氮、TOC和粒徑呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，硝化螺旋菌與總氮和TOC呈較明顯的正相關(guān)。反映出這些類群微生物對(duì)特征污染物的指示意義，也反映了其對(duì)典型污染物的潛在降解或吸附能力。

圖11 沉積物微生物組成與環(huán)境因子CCA排序Fig. 11 CCA ordination of marine sediment microbial composition and environmental factors

圖12 沉積物微生物組成與環(huán)境因子Pearson相關(guān)系數(shù)熱圖Fig. 12 Pearson correlation of marine sediment microbial composition and environmental factors by heatmap

3 討論

海洋沉積物是地球上最復(fù)雜的微生物棲息地，它是集化學(xué)物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境，海洋沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物種質(zhì)和基因資源（秦松等，2006）。作為高壓、高鹽的特殊生境，沉積物中更可能富集功能特異的微生物類群，有研究表明海洋微生物種類可能高達(dá)（Sogin et al.，2006）。海洋沉積物細(xì)菌群落是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在海洋碳、氮、磷和硫等生源要素的礦化和循環(huán)中具有關(guān)鍵作用（Kinghorn et al.，2009）。

眾多學(xué)者對(duì)我國近海沉積物微生物群落進(jìn)行了研究。孫靜（2014）同樣利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對(duì)我國黃東海近海海域沉積物樣品原核微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行研究。共獲得74個(gè)門類，變形菌門、浮霉菌門和泉生古菌門所占比例相對(duì)較高，分別占總數(shù)的44%、11.2%和9%，其中變形菌門在 37個(gè)沉積物樣品中均是優(yōu)勢類群。更多學(xué)者分別利用 PRC-DGGE等相關(guān)技術(shù)對(duì)我國近海海域進(jìn)行了表層沉積物多樣性研究，結(jié)果表明變形菌門在黃海、東海、椒江口和膠州灣海域沉積物樣品中均是最大的優(yōu)勢類群（宋志剛等，2006；劉欣等，2010；張健等，2010；黃備等，2017）。白潔等（2009）采用16S rDNA文庫技術(shù)，對(duì)黃海西北部海域沉積物不同季節(jié)的細(xì)菌群落特征進(jìn)行解析和評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉積物中細(xì)菌群落多樣性很豐富，包括變形細(xì)菌、浮霉菌、擬桿菌、厚壁菌等多個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌門，優(yōu)勢亞群是γ-和δ-變形細(xì)菌綱。本研究的結(jié)果與上述研究有相似之處，從門水平上看變形菌門在各站位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，而其它主要門類如酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門和浮霉菌門等在我國近海沉積物微生物群落中均有報(bào)道。從屬水平上看，Gammar變形菌在各站位中均是最主要的優(yōu)勢菌，這與Liu et al.（2015）對(duì)我國北部邊緣海沉積物細(xì)菌和古菌群落研究的結(jié)果一致。Naoki et al.（2009）在Sagami灣研究有機(jī)物富集梯度對(duì)海洋養(yǎng)殖場沉積物細(xì)菌群落的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)污染嚴(yán)重的測點(diǎn)，Gammar變形菌在未受污染影響的測點(diǎn)檢出的頻率更高；相反地Delta變形菌在受污染測點(diǎn)的相對(duì)豐度最高。本研究的測點(diǎn)均位于我國領(lǐng)?；€之外的黃海西部開闊海域，應(yīng)該說受沿岸影響相對(duì)較小，因而Gammar變形菌為最優(yōu)勢的類群，但圖2和圖3可知，由于多種環(huán)境因子的影響，研究海域中央氮、有機(jī)碳以及多種重金屬和有機(jī)物均形成了高值區(qū)，黃海西部海域一定程度地受到了沿岸人類活動(dòng)的影響，Delta變形菌也是微生物群落主要種類之一。

分析海域微生物群落的差異，從屬水平的Venn圖（圖8）可以發(fā)現(xiàn)，B組的特有物種最多，共有23屬；從海域微生物群落PCA圖（圖10）可見，B組中B5－B7測點(diǎn)比較接近且與其它測點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，由此也證實(shí)了B組中擁有相對(duì)較多的特有物種。眾多研究表明，海洋微生物的組成及其多樣性與環(huán)境溫度、季節(jié)、深度等環(huán)境條件相關(guān)（付新華等，2017）。從圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，B組各測點(diǎn)所在的位置，正好處于多種環(huán)境因子（如沉積物粒徑、總氮、TOC、鎘、鋁、錳、銅、鋅、多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴）變化最劇烈的海域。眾多環(huán)境因子在B組各測點(diǎn)的檢測值從低值上升到最高值，特殊的環(huán)境條件造成了較為獨(dú)特的微生物群落。

孫慧等（2016）在余姚濱海采集不同鹽堿度的土壤，對(duì)土壤微生物群落組成及土壤理化性質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：CCA排序表明，全磷對(duì)細(xì)菌群落的影響程度最大。吳玲等（2017）、錢瑋等（2017）采用熒光定量PCR及PCR-DGGE等方法對(duì)太湖細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)境中總氮、總磷和總有機(jī)質(zhì)含量是影響水體和沉積物微生物群落豐度的重要因素。與此類似，本研究通過CCA排序分析微生物門類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性（圖 11），研究發(fā)現(xiàn)總磷和沉積物粒徑對(duì)微生物門水平的群落分布具有顯著性影響?；谖⑸锶郝渑c環(huán)境因子間Pearson相關(guān)系數(shù)的熱圖分析結(jié)果呈示（圖 12），在研究海域酸桿菌、衣原體和硝化螺旋菌（Nitrospirae）與總磷呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。劉鵠等（2016）在研究水庫沉積物營養(yǎng)鹽與微生物群落分布狀況及遷移轉(zhuǎn)化的相互關(guān)系時(shí)，通過皮爾遜相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Gammar變形菌和Delta變形菌與總磷存在顯著的負(fù)相關(guān)性。這二類微生物正是本次研究最主要的微生物類群，由此也驗(yàn)證本研究關(guān)于總磷與多種細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果。

4 結(jié)論

（1）應(yīng)用Illumina MiSeq宏基因組高通量測序技術(shù)，在黃海西部海域沉積物中鑒定得到古菌和細(xì)菌共41門250科442屬。其中變形菌門在各站位均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，其相對(duì)豐度占總數(shù)的47%。其它較為豐富的門類包括酸桿菌門，放線菌門、擬桿菌門，浮霉菌門和疣微菌門。

（2）黃海西部海域一定程度地受到了沿岸人類活動(dòng)的影響，Delta變形菌成為微生物群落主要種類之一。研究海域中環(huán)境因子變化劇烈的區(qū)域，擁有較為獨(dú)特的微生物群落。

（3）通過微生物門類多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)總磷和沉積物粒徑對(duì)微生物門水平的群落分布具有顯著性影響。計(jì)算微生物門類組成與環(huán)境因子間Pearson相關(guān)系數(shù)并繪制熱圖分析，酸桿菌、衣原體和硝化螺旋菌與總磷呈較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。