李毳，劉怡

山西財經(jīng)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030006

微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能和多樣性受多種因素的影響，目前尚無一致的結(jié)論（柴永福等，2016）。研究表明環(huán)境選擇和擴散限制是影響微生物群落構(gòu)建的兩個重要方面，二者相對作用的大小因生物屬性、生境和研究尺度不同而存在差異（?？瞬?，2009）。植物根際土壤中生長著大量各種類型的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等（厲桂香等，2018）。植物和土壤因子對根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性具有重要的影響。根系分泌物介導(dǎo)了植物根際微生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量驅(qū)動微生物趨化過程，形成了植物所特有的根系核心微生物區(qū)系（Bulgarelli et al.，2012）。根系分泌物影響根際微生物的種類和數(shù)量，并對微生物的生長繁殖及代謝過程產(chǎn)生影響（Singh et al.，2004），植物通過根際“主動”選擇土壤微生物，盡管不能確定是否選擇了有益的微生物（Chaudhary et al.，2016），但這些微生物通過促進植物對礦質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、改善土壤的理化性質(zhì)，從而促進植物生長（Bais et al.，2004）。中藥材植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge）、地黃（Rehmannia glutinosa）等的酸性根系分泌物可以誘導(dǎo)厚垣孢子、卵孢子和菌核的萌發(fā)，影響土壤微生物的群落組成，細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加（嚴(yán)鑄云等，2012）。有多項研究表明，藥用植物能夠顯著影響其根際微生物種群的組成（Berendsen et al.，2012），長期種植地黃能夠顯著改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性（吳林坤等，2015）。Glassman et al.（2017）的研究發(fā)現(xiàn)pH和土壤營養(yǎng)在局域尺度上驅(qū)動真菌的群落的構(gòu)建，真菌群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)顯著正相關(guān)。在研究植物群落構(gòu)建的驅(qū)動力時，植物-微生物-土壤之間的相互作用很容易被忽視（Thompson et al.，2001），土壤理化因子與植物類型是否相互作用，影響土壤微生物多樣性還有待深入研究。

山西地形復(fù)雜，晉東南太行山區(qū)是傳統(tǒng)中藥材產(chǎn)區(qū)，中藥材資源豐富且歷史悠久，大宗中藥材道地品種連翹（Forsythia suspensa）、遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd）、黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）、黃芪（Astragalus membranaceus Fisch）、柴胡（Bupleurum chinese）、黨參（Codonopsis piloula）等都在全國形成規(guī)模。本研究中選取遠(yuǎn)志、柴胡、黨參3種野生道地藥材為研究對象，小尺度局域空間上探討 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)及其驅(qū)動因素。

1 研究區(qū)域與研究方法

1.1樣品采集

2018年5月，在山西省長治市武鄉(xiāng)縣石圪垤村（36°44′N，113°60′E）附近溝坡，選取地表植被基本均勻的樣地，選擇長勢、株齡（5年左右）相近的野生遠(yuǎn)志、柴胡和黨參各3株，共收集到9個樣品的根際土壤。具體方法參照Riley et al.（1969，1970）的抖落法：挖取具有完整根系的土體，輕輕抖落大塊不含根系的土壤，然后用力將根系表面附著的土壤全部抖落下來，混合后，密封于無菌塑料袋，置于車載冰箱保存，并盡快帶回實驗室。仔細(xì)去除新鮮土樣中可見的植物殘體及土壤動物等，將土樣分為兩份，一份風(fēng)干處理，用于土壤理化性質(zhì)的測定，一份提取土壤微生物基因組DNA，用于高通量測序。

1.2土壤理化性質(zhì)測定

土壤含水量用烘干法測定；土壤pH值用電位法HANNA HI3221測定（土水質(zhì)量比1∶2.5）；土壤全碳（TC）、全氮（TN）、全硫（TS）用元素分析儀（vario MACRO cube，Germany）測定；土壤硝態(tài)氮（NO3--N）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、銨態(tài)氮（NH4+-N）用CleverChem 380間斷元素分析儀測定；土壤粒度用粒度儀（Mastersizer 3000，Malvern，UK）測定，上機前對土壤進行前處理去除碳酸鹽和有機質(zhì)。

脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的NH3+-N的mg數(shù)表示；蔗糖酶采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養(yǎng)24 h 后1 g土壤產(chǎn)生的葡萄糖的mg數(shù)表示；過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法，其活性以20 min內(nèi)每克土壤分解的過氧化氫的mg數(shù)表示。

1.3土壤真菌群落分析

每種藥材的土壤取3個樣品，每個樣品分別稱取5 g，將鮮土樣送至北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序。基于Illumina HiSeq測序平臺，利用引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）和ITS2-Rev（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）對核糖體ITSⅠ高變區(qū)進行測序。

1.4數(shù)據(jù)分析

各樣地土壤理化變量之間的顯著性差異（P＜0.05）均采用單因素方差分析（SPSS 23.0 One-way analysis）和多重比較分析。使用FLASH v1.2.7軟件，通過overlap對每個樣品的reads進行拼接，得到的拼接序列即原始 Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）；使用Trimmomatic v0.33軟件，對拼接得到的 Raw Tags進行過濾，得到高質(zhì)量的 Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）；使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags），使用QIIME（version 1.8.0）軟件中的UCLUST[2]對 Tags在 97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。使用Mothur（version v.1.30）軟件，計算樣品的Alpha多樣性指數(shù)，包括反映微生物多樣性的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，群落豐富度指數(shù)Chao1指數(shù)和 ACE指數(shù)以及反映測序深度的Coverage指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1土壤理化性質(zhì)

土壤pH、TC、TS、土壤粒度、脲酶和蔗糖酶活性在3種不同植物的根際土間差異顯著，而土壤含水率、TN、NO3--N、NH4+-N、NO2--N、過氧化氫酶活性的差異不顯著（表 1）。所有土壤樣品的pH都大于7，為弱堿性土壤。黨參根際土的pH值最大（7.80）。TN、TC、TS在柴胡根際土中均為最大。土壤脲酶和蔗糖酶在樣品間差異顯著，柴胡根際土中的脲酶活性最高（6.54），蔗糖酶活性最低（8.64），黨參根際土中脲酶活性最低（0.55），蔗糖酶活性最高（11.40）。

2.2 3種藥材根際土壤真菌群落組成及其多樣性

圖1 不同植物根際真菌群落在門（a）和屬（b）水平的相對豐度及聚類分析（c）Fig. 1 The relative abundance of dominant fungal phylum (a) and genus(b), and cluster analysis(c) from rhizosphere of three plants

3種藥用植物的9個根際土壤樣品中共鑒定出9個真菌門和143個真菌屬，真菌群落分布格局具有一定規(guī)律性（圖1a），子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門 Basidiomycota相對豐度最大，黨參根際土壤中，擔(dān)子菌門的相對豐度顯著大于遠(yuǎn)志和柴胡，而子囊菌門的相對豐度顯著小于遠(yuǎn)志和柴胡。從9個樣品根際土壤群落中，共鑒定出相對豐度大于1%的優(yōu)勢真菌屬有9個，其中，絲蓋傘屬Inocybe（39.89%）、白環(huán)蘑屬Leucoagaricus（7.05%）在黨參根際真菌群落中占據(jù)顯著優(yōu)勢；被孢霉屬Mortierella（3.39%、8.34%、3.96%）分別在遠(yuǎn)志、黨參和柴胡根際中均占有顯著優(yōu)勢；Ramicandelaber屬（1.02%，3.79%）、Paraphoma屬（1.98%、1.60%）分別在遠(yuǎn)志和柴胡根際真菌群落中優(yōu)勢較大；Naganishia屬（4.77%）在遠(yuǎn)志根際群落中優(yōu)勢較大；Tetracladium屬（1.05%、2.64%）在黨參和柴胡根際土中優(yōu)勢較大；Ceratobasidium屬（1.96%）在柴胡根際土中優(yōu)勢較大（圖1b）。根際真菌屬水平豐度熱圖分析結(jié)果顯示（圖1c），遠(yuǎn)志、柴胡和黨參根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，黨參與遠(yuǎn)志、柴胡差異更大。

3種藥材植物根際土壤真菌群落α多樣性分析結(jié)果見表2。其中柴胡根際真菌群落Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小，因此，柴胡根際真菌群落多樣性最高，而均勻度較低。黨參的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說明黨參根際真菌群落的多樣性較低，而均勻度較高。遠(yuǎn)志的 ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最大，表明其根際真菌群落中種類數(shù)目最多；黨參根際真菌群落的ACE和Chao1指數(shù)最低。

表2 3種藥材根際土壤真菌群落多樣性Table 2 Diversity of fungal communities of three species rhizosphere

2.3環(huán)境因子對土壤真菌群落α多樣性的影響

土壤環(huán)境因子和α多樣性指數(shù)間的相關(guān)分析結(jié)果表明（圖2），根際真菌群落Simpson指數(shù)與根際土壤pH、蔗糖酶呈顯著負(fù)相關(guān)；Shannon指數(shù)與pH、蔗糖酶呈顯著負(fù)相關(guān)，與TN、TS和脲酶呈顯著正相關(guān)性。說明3種植物根際真菌群落的多樣性與土壤環(huán)境因子密切相關(guān)。

2.4環(huán)境因子與植物類型對土壤真菌群落的關(guān)系

NMDS分析結(jié)果表明3種藥用植物根際土壤真菌群落組成差異顯著（P＜0.05）（圖3a）。為了探究3種植物根際土壤真菌群落差異的驅(qū)動因素，對本研究區(qū)土壤中的優(yōu)勢真菌屬豐度和土壤理化因子、植物類型進行冗余分析（圖 3b），結(jié)果表明RDA1和RDA2分別解釋3種植物根際土壤真菌群落差異的44.41%和20.54%，其中土壤pH、蔗糖酶、脲酶、全氮對真菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著，且土壤 pH是解釋度最高的環(huán)境因子。

在植物分類學(xué)上，3種藥用植物分屬于遠(yuǎn)志科（Polygalaceae）、傘形科（Umbelliferae）和桔?？疲–ampanulaceae），植物的生理生態(tài)特征具有一定的差異。方差分解分析植物在科水平上的差異與土壤因子對植物根際微生物群落影響的相對大?。▓D4），結(jié)果顯示土壤、植物種類分別解釋了3種植物根際真菌群落差異的32%和27%，環(huán)境因子和植物類型的交互作用對其解釋為6%。表明土壤環(huán)境因子和植物類型對根際真菌群落均具有顯著的影響。

圖2 α多樣性指數(shù)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性矩陣圖Fig. 2 Correlation matrix diagram among α-diversity index and edaphic factors

圖3 優(yōu)勢真菌屬的NMDS分析及其與土壤環(huán)境因子和植物類型的冗余分析Fig. 3 NMDS analysis of dominant fungi genus (a) and RDA analysis of dominant fungi genus constrained by edaphic factor (b)

圖4 方差分解分析土壤環(huán)境因子和植物類型對真菌群落影響相對大小Fig. 4 Variation partitioning analysis showing the percentages of variance in fungal communities explained by soil environment factor and medicine plant type

3 討論

3.1土壤環(huán)境因子對植物根際真菌群落的影響

微生物作為土壤地球物質(zhì)化學(xué)循環(huán)的主要參與者，其群落結(jié)構(gòu)和功能受到土壤環(huán)境因子的影響。環(huán)境因子和擴散限制對于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響作用的相對大小，因微生物屬性（細(xì)菌、真菌、原生動物）、生境類型、研究尺度的不同而不同。就環(huán)境因子而言，不同的土壤因子（pH、鹽度、溫度、濕度、土壤酶等）與微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的關(guān)系不盡一致。Burns et al.（2015）在美國博德加灣附近研究了 14種不同植被類型的土壤微生物群落多樣性，發(fā)現(xiàn)在局域尺度下，植物種、土壤化學(xué)特征和空間因素對土壤真菌和細(xì)菌群落的多樣性均具有顯著的影響。對華北落葉松林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究顯示，土壤理化因子和地上植被多樣性對真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性具有顯著影響，而且在測定的 10種土壤因子中，不同的真菌門與各種土壤理化因子（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和鹽度）的相關(guān)性存在差異（趙鵬宇等，2018）。王淼等（2013）在罕山通過研究不同林型下土壤微生物特性時，發(fā)現(xiàn)土壤有機質(zhì)和土壤含水率對真菌群落結(jié)構(gòu)和代謝多樣性的貢獻率很高。Cox et al.（2010）的研究表明生態(tài)系統(tǒng)中真菌群落的分布與土壤氮的含量密切相關(guān)。本研究在微尺度上分析了3種藥用植物根際真菌群落的結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示土壤 TN、pH、脲酶及蔗糖酶對真菌群落有顯著影響。本研究中植物根際子囊菌門和擔(dān)子菌門相對豐度較高，它們不僅是土壤真菌群落中有機質(zhì)的主要分解者（Yelle et al.，2010），而且二者與植物共生形成菌根，參與根際氮素的循環(huán)，對植物的生長發(fā)育具有重要作用。許多研究結(jié)果都表明，土壤菌根菌（叢枝菌根真菌、外生菌根菌）與土壤pH的顯著相關(guān)（Kluber et al.，2012），與本研究結(jié)果一致。

3.2植物物種類型與根際土壤微生物的相關(guān)性

植物類型對根際土壤微生物群落的“選擇”主要是通過植物根系分泌物來實現(xiàn)的（Singh et al.，2004），特別是菌根真菌類等與植物共生的微生物，是根際微生物群落的主要組成物種。根系分泌物是植物與土壤進行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要載體物質(zhì)，是植物響應(yīng)外界脅迫的重要途徑，也是構(gòu)成不同植物微生態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素（Bais et al.，2006）。根系分泌物為微生物提供碳源，驅(qū)動土壤微生物營養(yǎng)循環(huán)（N、S、P）過程（劉純等，2013）。根系分泌物的種類和數(shù)量決定了根際微生物的多樣性和豐度，并對微生物的生長繁殖及代謝過程產(chǎn)生影響（袁秀梅等，2016；Hu et al.，2018）。藥用植物根際分泌物中豐富的糖類、氨基酸及維生素等對土壤微生物的種類、數(shù)量及植物根際的分布具有顯著的影響（Chaudhary et al.，2016）。不同藥用植物可以通過根系分泌物作用于根圍環(huán)境，產(chǎn)生根際效應(yīng)，影響根際土壤微生物的群落多樣性和結(jié)構(gòu)。

在本研究中，土壤環(huán)境因子和植物是植物根際真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要驅(qū)動因子，土壤-植物-微生物相互作用，土壤為植物和微生物提供載體和礦質(zhì)營養(yǎng)，植物為土壤提供碳源和有機質(zhì)，微生物驅(qū)動碳、氮、硫、磷等物質(zhì)化學(xué)循環(huán)過程。土壤、植物、微生物相互作用，形成特定的土壤生態(tài)系統(tǒng)，為“道地”藥材的生長提供了特異的生境。道地藥材的形成有其歷史條件、地理條件和生長的環(huán)境因子，“道”的形成就是不同的藥材基因型和環(huán)境因子互相作用的產(chǎn)物。山西太行山地區(qū)自古以來就是黨參、柴胡以及遠(yuǎn)志的重要產(chǎn)區(qū)，野生黨參、柴胡、遠(yuǎn)志的生長也表明環(huán)境因子起到了重要的作用。

4結(jié)論

柴胡、黨參和遠(yuǎn)志3種野生道地藥材根際真菌群落主要受土壤環(huán)境因子和植物類型的影響，且土壤環(huán)境因子是根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要驅(qū)動因素，同時，植物類型也發(fā)揮重要作用，體現(xiàn)了植物-土壤-微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的協(xié)同關(guān)系，為道地中藥材的生長提供了特定的生境。