齊學(xué)禮，李 艷，王玉民，韓留鵬，張 磊，胡 琳，許為鋼

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/小麥國家工程實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002)

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，其產(chǎn)量的持續(xù)提高對保障我國糧食安全具有重大戰(zhàn)略意義。目前，小麥單產(chǎn)水平的提高主要是由于品種產(chǎn)量潛力遺傳改良和生產(chǎn)條件改善的結(jié)果，而產(chǎn)量潛力的遺傳改良主要通過形態(tài)性狀改良來實(shí)現(xiàn)，但在現(xiàn)有小麥品種產(chǎn)量水平已相對較高、葉面積指數(shù)和收獲系數(shù)都已接近極限的情況下，再單純依靠形態(tài)性狀遺傳改良已很難提高產(chǎn)量[1-4]。因此，小麥產(chǎn)量的進(jìn)一步提高在一定程度上取決于品種光合生理特性的進(jìn)一步改善[5-6]。在光呼吸途徑經(jīng)多基因轉(zhuǎn)化等技術(shù)重新設(shè)計(jì)后，轉(zhuǎn)基因煙草和水稻的光合生理特性得到了極大改善，光能利用率、生物量和產(chǎn)量均較野生型對照大幅提高[7-8]。

目前，將丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)、依賴于NADP的蘋果酸酶(NADP-Malic enzyme, NADP-ME)等C4光合途徑關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)入到小麥、水稻等C3作物中，改善C3作物光合作用的內(nèi)在遺傳基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)其光合速率和產(chǎn)量的提高一直是植物生物科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)之一[9-16]。其中，PPDK位于葉肉細(xì)胞的葉綠體中，催化CO2最初受體磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的再生，該酶催化的反應(yīng)是C4光合途徑的重要限速步驟[17]。Ishimaru[9-10]首先將玉米C4型PPDK基因?qū)氲綌M南芥和馬鈴薯中，獲得的轉(zhuǎn)基因材料PPDK活性較對照顯著提高，但光合速率提高不顯著；隨后Ku等[11]將該基因轉(zhuǎn)入到水稻中，使轉(zhuǎn)基因水稻的光合速率較對照提高35%。本課題組長期開展玉米C4途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化小麥的研究，從玉米中分離克隆了高光效ZmPPDK基因[12]，采用基因槍法導(dǎo)入到河南省小麥大面積推廣品種周麥23中，獲得了轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥。本研究以其T2代轉(zhuǎn)基因小麥株系T14和T39為材料，分析了其光合和產(chǎn)量特性，以期為C3植物高光效基因工程與小麥產(chǎn)量遺傳改良研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與田間種植

供試材料為T2代轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥株系T14和T39及野生型對照周麥23。2016年10月將試驗(yàn)材料種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，2017年4-6月進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)地耕層土壤有機(jī)質(zhì)含量為12.61 mg·kg-1，堿解氮含量為85.18 mg·kg-1，有效磷含量為29.74 mg·kg-1，速效鉀含量為188.50 mg·kg-1。播種前施雞糞3 000 kg·hm-2和復(fù)合肥750 kg·hm-2，小區(qū)面積13.37 m2(8.52 m×1.57 m)，基本苗270×104株·hm-2，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，常規(guī)栽培管理。

1.2 方 法

1.2.1ZmPPDK基因遺傳轉(zhuǎn)化過程

2015年5月取周麥23灌漿中期(花后15 d左右)的籽粒，用70%的乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，再用0.1%的HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗3次，用解剖刀剝出幼胚，選用1 mm左右的幼胚，放到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，于25 ℃暗培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)移至高滲培養(yǎng)基，滲透處理5 h后進(jìn)行基因槍轟擊，將玉米C4型ZmPPDK基因與BAR基因共同導(dǎo)入，完成轟擊后繼續(xù)高滲處理16 h，轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d，轉(zhuǎn)至草丁磷抗性篩選(濃度為3 mg·L-1)再生培養(yǎng)基，連續(xù)篩選2次，非抗性愈傷褐化死亡，而抗性愈傷則正常生長發(fā)育并分化為小麥幼苗(圖1A)，然后將其轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基上，待抗性植株長至10 cm、具有較好的根系時(shí)(圖1B)，打開培養(yǎng)瓶蓋子，煉苗3 d后，移栽到花盆中，共獲得具有草丁膦抗性的再生小麥植株190株(圖1C)，2016年10月獲得T0代種子?；驑屴Z擊參數(shù)：靶距為9 cm，每槍含質(zhì)粒DNA1 μg，金粉250 μg，金粉直徑為1 μm，轟擊壓1 100 psi。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：MS + 2 mg·L-12,4-D + 0.4%瓊脂 + 3%蔗糖，pH 6.2；高滲培養(yǎng)基配方：MS+2 mg·L-12,4-D + 0.7%瓊脂 +甘露醇 (0.4M)+ 3%蔗糖，pH 5.8；分化培養(yǎng)基：1/2 MS + 0.5 mg·L-1NAA + 2.0 mg·L-1KT + 0.4%瓊脂+ 3%蔗糖，pH 6.2；生根培養(yǎng)基配方：1/2 MS + 0.2 mg·L-1NAA + 0.4%瓊脂+3%蔗糖，pH 6.5。

A：抗性愈傷組織；B：抗性植株；C：移栽至花盆的抗性植株。

A: glufosinate-resistant callus; B: glufosinate-resistant plants in culture flask; C: glufosinate-resistant plants transplanted to flower box.

圖1 具有草丁膦抗性的轉(zhuǎn)基因植株獲得過程

Fig.1 Process from callus to glufosinate-resistant plants

參考柴建芳等[18]的方法，提取拔節(jié)期小麥葉片的基因組DNA。以T2代轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥葉片基因組DNA為模板進(jìn)行目的基因PCR檢測，野生型對照周麥23為陰性對照，以轉(zhuǎn)化的載體質(zhì)粒為陽性對照，轉(zhuǎn)基因小麥T14、T39與陽性對照均擴(kuò)增到了預(yù)期的778 bp條帶，陰性對照無目的條帶(圖2)，T14和T39的基因陽性率分別為66.06%和71.43%，表明外源ZmPPDK基因已整合到受體品種周麥23基因組中且可遺傳到下一代植株。

1～3：T14植株；4～7：T39植株；8：野生型對照植株；9：陽性對照；M：DL2000。

1-3:T14 plant;4-7:T39 plant; 8:Wild type plant; 9:Positive control; M: DL2000.

圖2 轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥的目的基因PCR檢測

Fig.2 PCR analysis ofZmPPDKgene in transgenic wheat

1.2.2 基因表達(dá)量測定

按照天根生化科技(北京)有限公司RNA提取試劑盒說明書，提取開花期和灌漿期(花后 15 d)小麥旗葉RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒選用Rever Tre Ace qPCR RT Kit(TOYOBO, Japan)，熒光定量試劑盒選用SYBRPremix Ex TaqTMII，均購于寶生物工程(大連)有限公司。熒光定量反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40循環(huán)。基因的引物依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號所對應(yīng)的序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)。目的基因和內(nèi)參基因及其引物見表1。在Bio-Rad CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，3次重復(fù)，用2-△△Ct法計(jì)算基因相對表達(dá)量[19]。

表1 qRT-PCR分析所用引物序列Table 1 Primers for real-time PCR analysis

1.2.3 光合速率測定

在小麥開花期和灌漿期(花后15 d)，選擇晴朗無云的天氣，利用美國PP SYSTEMS公司生產(chǎn)的CIRAS-3型便攜式植物光合作用測定儀，測定小麥旗葉凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)日變化，每2 h測定3次重復(fù)，供氣方式選擇大氣供氣，氣體流速設(shè)置為300 mL·min-1，光源選擇自然光。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

按照Genty等[20]方法，在小麥開花期和灌漿期(花后15 d)，選擇晴朗無云的天氣，利用英國漢莎公司生產(chǎn)的FMS-2便攜脈沖調(diào)制式熒光儀，測定小麥旗葉的最大光化學(xué)效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm和實(shí)際光化學(xué)效率ФPSII=(Fm-Fs)/Fm；按照Strasser等[21]方法，利用英國漢莎公司生產(chǎn)的Handy PEA型連續(xù)激發(fā)式熒光儀，測定小麥旗葉的K點(diǎn)相對可變熒光WK=(FK-Fo)/(FJ-Fo)和J點(diǎn)相對可變熒光VJ=(FFj-Fo)/(Fm-Fo)，3次重復(fù)。

1.2.5 產(chǎn)量性狀測定

灌漿期調(diào)查1 m雙行樣段的有效穗數(shù)，折合成每公頃穗數(shù)。成熟期收獲每小區(qū)全部穗子，實(shí)打測產(chǎn)，并測定千粒重。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法進(jìn)行多重比較，Microsoft Excel 2010繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 轉(zhuǎn)基因小麥的旗葉光合速率日變化

測定結(jié)果(圖3)表明，轉(zhuǎn)基因小麥T14和T39及野生型對照(WT)開花期和灌漿期的旗葉光合速率(Pn)日變化趨勢一致，均呈現(xiàn)典型的“雙峰”曲線，T14和T39的Pn值在10:00- 14:00顯著高于WT。開花期T14和T39的最大Pn值分別為25.6和26.0 μmol·m-1·s-1， 14:00時(shí)Pn值與WT差異最大，分別較WT提高 12.46%和12.27%；灌漿期最大Pn值分別為 22.8和 21.9 μmol·m-2·s-1，12:00Pn值與WT差異最大，分別較WT提高17.24%和21.11%。

2.2 轉(zhuǎn)基因小麥光合基因的表達(dá)變化

經(jīng)檢測，與WT相比，開花期轉(zhuǎn)基因小麥T14和T39的ZmPPDK及內(nèi)源基因CA、NADP-ME、FBP的表達(dá)量均顯著升高，其中ZmPPDK的表達(dá)量升高幅度最大，較WT分別提高9.27和10.40倍；灌漿期ZmPPDK、CA、NADP-ME、FBP基因的表達(dá)量較開花期均顯著降低，但4個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因小麥T14和T39中的表達(dá)量仍顯著高于WT，且增幅高于開花期，其中ZmPPDK基因增幅最大，分別較對照提高14.13和15.28倍(圖4)。

曲線上同一時(shí)刻數(shù)據(jù)上標(biāo)注的不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。

Data at the same time followed by different letters are significantly different among the materials at 0.05 level.

圖3 轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥與野生型對照(WT)的光合速率日變化

Fig.3 Diurnal variation of net photosynthetic rate in transgenic wheat and WT

柱狀圖上不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。圖5同。

Different letters above the columns are significantly different among the materials at 0.05 level.The same in figure 5.

圖4 外源ZmPPDK基因及內(nèi)源光合相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因小麥與野生型對照(WT)中的表達(dá)量

Fig.4 Relative expression levels ofZmPPDKand genes related to photosynthesis in transgenic wheat and WT

2.3 轉(zhuǎn)基因小麥的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化

8:00時(shí)轉(zhuǎn)基因小麥的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSII、WK、VJ值與WT均無顯著差異(圖5)。13:00時(shí)由于高溫強(qiáng)光的脅迫，轉(zhuǎn)基因小麥和WT的Fv/Fm和ΦPSII值均顯著下降，但T14與T39顯著高于WT；小麥WK與VJ值較8:00均顯著上升，但T14與T39顯著低于WT。這說明轉(zhuǎn)基因小麥PSII的活性、光化學(xué)效率和電子傳遞能力均優(yōu)于野生型對照。

2.4 轉(zhuǎn)基因小麥的產(chǎn)量特點(diǎn)

與WT相比，轉(zhuǎn)基因小麥T14與T39的產(chǎn)量兩年均顯著增加，兩年平均產(chǎn)量的增幅分別為 6.40%和5.02%；轉(zhuǎn)基因小麥的成穗數(shù)和穗粒數(shù)無顯著變化，而千粒重顯著增加，兩年平均千粒重的增幅分別為6.63%和6.81%。這說明轉(zhuǎn)基因小麥增產(chǎn)的主要原因是千粒重增加(表2)。

A～D:開花期，E～H:灌漿期。 A-D:Anthesis stage; E-H:Grain filling stage.

圖5 轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥與野生型對照(WT)在8:00與12:00的葉綠素?zé)晒鈪?shù)

同列數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示材料間差異顯著(P<0.05)。

Data in same column followed by different letters are significantly different among the materials at 0.05 level.

3 討 論

植物學(xué)家和作物育種學(xué)家一直都致力于將C4途徑的光合關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)化到C3植物中，以達(dá)到提高C3作物光合效率，進(jìn)而提高生物量和產(chǎn)量的目的。許多研究人員開展了將C4光合途徑關(guān)鍵酶基因PPDK轉(zhuǎn)化C3植物的研究[9-13]。Ku等[11]將玉米C4型PPDK基因轉(zhuǎn)入到水稻后，轉(zhuǎn)基因水稻的光合速率較對照提高35%。本研究也發(fā)現(xiàn)，在開花期和灌漿期轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥T14和T39的10:00-14:00光合速率顯著高于野生型對照，最高可增加21.1%。但I(xiàn)shimaru等[9-10]將玉米C4型PPDK基因?qū)氲綌M南芥和馬鈴薯后，轉(zhuǎn)基因擬南芥和馬鈴薯的光合速率沒有提高。上述結(jié)果說明，玉米C4型PPDK基因在不同C3植物中表現(xiàn)出的功能不盡相同，這可能與不同作物的遺傳背景不同有關(guān)。此外，本課題組獲得的轉(zhuǎn)ZmPPDK基因小麥中部分株系的光合速率與野生型對照相比無差異或降低(未發(fā)表數(shù)據(jù))，這可能是基因插入位點(diǎn)與拷貝數(shù)不同所致。因此，轉(zhuǎn)基因小麥新品種培育成功的前提是獲得一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因株系，轉(zhuǎn)化體數(shù)量少則難以從中篩選出目標(biāo)性狀較對照顯著改善的株系。

通過研究轉(zhuǎn)基因小麥與對照的光合速率日變化發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小麥在10:00-14:00期間的光合速率顯著高于野生型對照，其他時(shí)間則無顯著差異。10:00-14:00是一天中氣溫最高的時(shí)刻，特別在小麥生育后期更是強(qiáng)光高溫同時(shí)存在的時(shí)刻，說明轉(zhuǎn)基因小麥較對照具有更好的耐強(qiáng)光高溫特性，表現(xiàn)出了類C4植物特性。秦立琴等[28]和金立橋等[29]通過測定花生和黃瓜的快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)光高溫脅迫影響植物的PSII活性。本研究表明，在中午13:00強(qiáng)光高溫脅迫時(shí)刻，轉(zhuǎn)基因小麥較對照具有較好的最大光化學(xué)效率和實(shí)際光化學(xué)效率，且PSII的電子供體側(cè)與受體側(cè)受傷害程度均顯著低于對照，說明在中午強(qiáng)光高溫等逆境脅迫下轉(zhuǎn)基因小麥的電子傳遞鏈活性顯著優(yōu)于對照，可為暗反應(yīng)階段提供更多的能量，進(jìn)而維持較高的光合速率。

在小麥生育后期經(jīng)常遭遇高溫、強(qiáng)光等逆境，影響小麥籽粒發(fā)育，降低千粒重[30]。超高產(chǎn)小麥的生育后期旗葉功能顯著優(yōu)于中產(chǎn)小麥，有利于形成高千粒重[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小麥的千粒重顯著高于對照，是其增產(chǎn)的主要因素，這主要因?yàn)橥庠碯mPEPC基因可提高小麥生育后期的光合速率，進(jìn)而促進(jìn)后期同化物生產(chǎn)和積累，為籽粒灌漿提供充足的底物，最終形成較高的千粒重，也說明轉(zhuǎn)ZmPEPC基因小麥在生育后期較對照具有更好耐高溫強(qiáng)光特性。Gu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下玉米PPDK基因可提高水稻的千粒重和產(chǎn)量，與本研究結(jié)果相似。有關(guān)PPDK基因提高小麥千粒重的分子機(jī)制有待深入研究。