程麗娟，劉貴珊，萬(wàn)國(guó)玲，何建國(guó)

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

1 引言

靈武長(zhǎng)棗是一種天然保健品，為寧夏回族自治區(qū)特有的一種鮮食棗品種，由于有利的氣候和土壤環(huán)境使長(zhǎng)棗口感鮮美、質(zhì)地酥脆、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，被稱為“棗中之王”[1-2]。糖是長(zhǎng)棗果實(shí)可溶性固形物主要組成成分，其含量直接影響著靈武長(zhǎng)棗的甜度及風(fēng)味，長(zhǎng)棗果實(shí)中主要可溶性糖為果糖、葡萄糖和蔗糖[3]，葡萄糖為一種單糖，與其他糖相比，葡萄糖更容易被人體吸收，而且吸收后能直接為人體各個(gè)組織所利用[4]。對(duì)于糖含量的測(cè)量，一般都采用折射儀、糖度計(jì)、蒽酮法等幾種傳統(tǒng)方法，屬于有損檢測(cè)，存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜、樣品破壞強(qiáng)度大等問(wèn)題，而且傳統(tǒng)方法測(cè)的都是總糖含量，無(wú)法實(shí)現(xiàn)具體某一種糖含量的檢測(cè)。

本文以靈武長(zhǎng)棗作為研究對(duì)象，利用高光譜成像技術(shù)采集長(zhǎng)棗400～1 000 nm的光譜數(shù)據(jù)，選取正交信號(hào)校正法(Orthogonal signal correction，OSC)、多元散射校正(Multiple scattering correction，MSC)、卷積平滑(Savitzky-Golay，SG)、去趨勢(shì)(Detrending)、高值濾波(Gaussian-filter，GF)、中值濾波(Median-filter，MF)等6種預(yù)處理方法減少噪音干擾，結(jié)合PLSR建模方法優(yōu)選最佳的預(yù)處理方法；使用間隔隨機(jī)蛙跳算法(Interval random frog，IRF)、競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)加權(quán)算法(Competitive adaptive reweighted sampling，CARS)、反向區(qū)間偏最小二乘法(Backw ard interval PLS，BiPLS)、連續(xù)投影算法(Successie projection algorithm，SPA)、無(wú)信息消除變量(Uninformative variable elimination，UVE)等5種數(shù)據(jù)降維方法，結(jié)合使用偏最小二乘回歸(Partial least squares regression，PLSR)和多元線性回歸(Multivariable linear regression，MLR)2種建模方法分別對(duì)全波段和特征波段建模，選取最優(yōu)模型，為長(zhǎng)棗中葡萄糖含量的快速檢測(cè)奠定理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 材料與試劑

靈武長(zhǎng)棗采購(gòu)于寧夏靈武果業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司，采摘后的長(zhǎng)棗放置于低溫保鮮盒中運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，將大小均一、顏色鮮紅、表面光滑的長(zhǎng)棗樣本擦拭、用密封袋密封并依次編號(hào)，置于實(shí)驗(yàn)室冰箱中4 ℃冷藏。每隔5 d測(cè)試一次(貯藏期1,6,11,16,21,26,31 d，共計(jì)7次)，每次隨機(jī)取21個(gè)長(zhǎng)棗作為試驗(yàn)樣本。

葡萄糖標(biāo)品,四川省維克奇生物科技有限公司；濾頭(0.45 μm)、水系膜(0.45 μm×50 mm)、乙醇(色譜級(jí))，天津科大貿(mào)化學(xué)試劑廠。

2.2 儀器

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的儀器主要為：AGILENT型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司)；Hyper Spec VIS/NIR 高光譜成像系統(tǒng)(美國(guó)Headwall Photonics 公司)，如圖1所示。

圖1 Vis/NIR 高光譜成像系統(tǒng)Fig.1 Vis/NIR hyperspectral imaging system

2.3 高光譜信息采集

實(shí)驗(yàn)之前將高光譜成像系統(tǒng)打開預(yù)熱30 min，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了光譜掃描的最佳參數(shù)：CCD相機(jī)曝光時(shí)間20 ms,物鏡高度385 mm,掃描長(zhǎng)度70 mm,電控位移平臺(tái)速度200 μm/s。在完成對(duì)整個(gè)長(zhǎng)棗果實(shí)的掃描后，通過(guò)光譜矩陣的空間組合，構(gòu)建三維空間和光譜數(shù)據(jù)立方體，高光譜圖像用白色和暗色參考圖像進(jìn)行校準(zhǔn)[10,23]。校正圖像(R0)使用下列公式計(jì)算：

(1)

其中，R0是黑白校正后的長(zhǎng)棗反射率圖像數(shù)據(jù)，R是長(zhǎng)棗原始數(shù)據(jù)，RD是暗反射圖像數(shù)據(jù)(反射率0%)，RW是白色反射率圖像數(shù)據(jù)(反射率約100%)。

2.4 葡萄糖含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg(精確至0.000 1 g)，加入少量超純水溶解并定容至5 mL容量瓶?jī)?nèi)，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液。準(zhǔn)確吸取2 mL葡萄糖溶液于5 mL容量瓶中定容，制備成質(zhì)量濃度為8 mg/mL的葡萄糖溶液。按照對(duì)應(yīng)比例稀釋，依次制備其他濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，最后得到質(zhì)量濃度均為0.5，1，2，4，8 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

提取液的制備：采集長(zhǎng)棗樣本，削皮，取1 g果肉研磨搗碎，加入10 mL 無(wú)水乙醇進(jìn)行均質(zhì)、超聲提取半小時(shí)，11 000 r/min的離心機(jī)中離心15 min后收集上清液，在剩下的殘?jiān)屑尤? mL 無(wú)水乙醇再一次提取，將兩次所得的上清液合并。55 ℃真空旋干，超純水溶解并定容到25 mL容量瓶刻度線位置，充分搖勻，測(cè)試前用0.45 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾，流動(dòng)相為超純水進(jìn)行反復(fù)測(cè)試。

2.5 圖像處理

利用高光譜成像系統(tǒng)采集樣品圖像后，使用ENVI4.8(Research System Inc，USA)軟件選取長(zhǎng)棗光譜圖像赤道位置大約30 pixel×30 pixel的區(qū)域作為感興趣區(qū)域(Region of interest，ROI)，計(jì)算出的平均光譜值作為該長(zhǎng)棗的反射光譜。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用The Unscrambler X 10.4軟件對(duì)光譜預(yù)處理，圖像分析軟件為ENVI 4.8，利用Matlab R2014a軟件進(jìn)行建模、劃分樣本集，繪圖軟件為origin 8。

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC測(cè)量結(jié)果

圖2為長(zhǎng)棗提取液的高效液相色譜出峰圖，葡萄糖出峰時(shí)間為13.42 min，與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)。線性方程為y=4.5050×10-6x-2.40×10-2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明兩者具有良好的線性相關(guān)性。精密度、回收率的測(cè)定結(jié)果分別見表1、2，精密度測(cè)試結(jié)果表明長(zhǎng)棗樣品的峰面積基本穩(wěn)定，通過(guò)計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD為0.31%)<1%，表明該方法精密度高；加標(biāo)回收率為92.84%～98.01%，平均回收率為95.43%，有較高的準(zhǔn)確性。

圖2 長(zhǎng)棗提取液的高效液相色譜出峰圖Fig.2 High performance liquid chromatographic peak of jujube

表1 精密度結(jié)果Tab.1 Precision result of sample

表2 加標(biāo)回收率結(jié)果Tab.2 Recoverles from sample

3.2 樣本劃分

采用蒙特卡羅法共檢測(cè)出5個(gè)異常樣本，分別為93,109,118,137,144樣本。剔除異常樣本后，相關(guān)系數(shù)Rc由0.680 5增大到0.766 3；然后使用SPXY算法將剩余的142個(gè)樣本按照3∶1的比例劃分成107個(gè)校正集和35個(gè)預(yù)測(cè)集，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

表3 長(zhǎng)棗葡萄糖含量數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of jujube glucose content

3.3 篩選最佳預(yù)處理方法

表4為原始光譜以及預(yù)處理光譜的PLSR建模結(jié)果，由相關(guān)系數(shù)、均方根誤差評(píng)價(jià)模型穩(wěn)定性，圖3為幾種預(yù)處理光譜。可以看出使用OSC預(yù)處理方法，建模效果降低，因此，經(jīng)過(guò)預(yù)處理的光譜建模效果不一定高于原始光譜模型效果；使用其他幾種預(yù)處理方法，模型相關(guān)系數(shù)均高于原始光譜，均方根誤差低于原始光譜，說(shuō)明這幾種預(yù)處理方法可以消除噪音干擾，提高建模效果；經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)和圖像對(duì)比分析，確定SG(7)為最佳預(yù)處理方法。

表4 不同預(yù)處理方法的PLSR模型Tab.4 PLSR methods of different spectra pretreatment

圖3 不同預(yù)處理方式的光譜曲線。(a)MSC處理；(b)OSC處理；(c)De-trending處理；(d)SG(7)處理；(e)GF處理；(f)MF處理。Fig.3 Spectral curves with different pretreatment．(a)MSC treatment.(b)OSC treatment.(c)De-trendingtreatment.(d)SG(7)treatment.(e)GF treatment.(f)MF treatment.

3.4 光譜數(shù)據(jù)降維

3.4.1 SPA算法選取特征波長(zhǎng)

SPA算法可以在很大程度上精簡(jiǎn)模型，應(yīng)用SPA選取特征波長(zhǎng)時(shí)，設(shè)置變量范圍為5～25，歸一化處理后得到前5個(gè)波長(zhǎng)變量下的RMSECV值，如圖4所示，分別為 401，415，425，641，699 nm。

3.4.2 UVE提取特征波長(zhǎng)數(shù)

設(shè)置五折交互驗(yàn)證，運(yùn)行程序得到輸入變量的穩(wěn)定性結(jié)果，如圖5所示。

圖4 SPA提取的特征波長(zhǎng)數(shù)Fig.4 Number of characteristic wavelengths extracted by SPA

圖5豎線左右兩側(cè)各為125個(gè)變量(左邊為波長(zhǎng)變量，右邊為隨機(jī)變量)。用該方法共選取了15個(gè)特征波長(zhǎng)，分別為 449，463，502，506，554，607，612，617，622，627，679，727，886，924，929 nm。

圖5 UVE-PLSR穩(wěn)定性分布曲線Fig.5 Stability distribution curve of UVE-PLSR model

3.4.3 CARS算法提取特征波長(zhǎng)

CARS挑選特征波長(zhǎng)的參數(shù)設(shè)置為：蒙特卡洛采樣次數(shù)為300，交互驗(yàn)證組數(shù)為10，篩選過(guò)程如圖6。曲線(a)為篩選特征波長(zhǎng)數(shù)的過(guò)程，運(yùn)行次數(shù)逐漸加大，波長(zhǎng)數(shù)呈現(xiàn)由快到慢的遞減趨勢(shì)，最后下降幅度趨于平緩，體現(xiàn)了波長(zhǎng)變量篩選的粗選與精選；曲線(b)表示RMSECV的變化趨勢(shì)，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，剛開始RMSECV值不斷減小，說(shuō)明CARS方法在運(yùn)行過(guò)程中無(wú)關(guān)變量被消除，隨著運(yùn)行次數(shù)的增加，RMSECV值趨于平緩，說(shuō)明變量變化不明顯，最后，RMSECV值持續(xù)上升，說(shuō)明一些關(guān)鍵變量數(shù)被消除；曲線(c)中的每條線代表回歸系數(shù)的變化趨勢(shì)，*號(hào)表示RMSECV最小的位置，CARS選出的18個(gè)特征波長(zhǎng)分別為478，554，588，670，675，679，737，756，780，795，804，843，852，895，924，948，958，963 nm。

圖6 CARS法選取波長(zhǎng)變量過(guò)程Fig.6 Process of selecting wavelength variables by CARS method

3.4.4 IRF提取特征波長(zhǎng)

IRF[24]參數(shù)設(shè)置如下：迭代次數(shù)N=3 000，子間隔初始值Q=50，間隔寬度W=15，最大主成分?jǐn)?shù)為20。運(yùn)行IRF程序后得到111個(gè)間隔中排名前10的間隔，具體見表5；組合間隔的 RMSECV值如圖7所示。

表5 靈武長(zhǎng)棗葡萄糖含量光譜數(shù)據(jù)排名前10的波長(zhǎng)間隔Tab.5 Top ranked 10 wavelength interval of Lingwu long jujube spectral data

圖7 組合間隔的RMSECV值Fig.7 RMSECV value of the combined interval

從表5可以得出，前10個(gè)區(qū)間選出的波點(diǎn)范圍是46～60、65～87、90～115，但圖7顯示，RMSECV值最低時(shí)，組合間隔數(shù)為22，因此，排名前22間隔的波長(zhǎng)被選作為特征波長(zhǎng)，這些波長(zhǎng)依次是35～87號(hào)、90～117號(hào)，具體是564～814 nm、828～958 nm，總共61個(gè)波長(zhǎng)。

3.4.5 BiPLS提取特征波長(zhǎng)

使用BiPLS[25]法提取特征波長(zhǎng)時(shí)將整條光譜分為12個(gè)子間隔，采用留一法交叉驗(yàn)證計(jì)算各個(gè)區(qū)間及組合區(qū)間的RMSECV 值，結(jié)果如表6所示。

表6 12個(gè)子區(qū)間數(shù)的BiPLS優(yōu)化結(jié)果Tab.6 Optimization results of 12 subinterval numbers

由表6可以看出，當(dāng)入選區(qū)間為[5，8，9，10，11]時(shí)，RMSECV值最小，利用BiPLS總共選擇出51個(gè)波長(zhǎng)，其相對(duì)應(yīng)的特征變量主要分布在598～641 nm和742～943 nm。

3.5 建立模型

對(duì)全波段和特征波段分別建立PLSR、MLR模型，如表7所示。整體來(lái)看，使用SPA、UVE算法提取特征變量數(shù)后的建模效果均低于全波段模型，而其他提取方法建模效果和全波段相當(dāng)，甚至優(yōu)于全波段模型結(jié)果；鑒于IRF、BiPLS方法提取的特征波長(zhǎng)數(shù)較多，使用CARS算法在此基礎(chǔ)上再次降維處理，以減少波段數(shù)；對(duì)比分析16種模型，建模效果最優(yōu)的是PLSR-IRF+CARS，Rc=0.835 3，Rp=0.832 2。

表7 不同波長(zhǎng)提取方法建立的的PLS和MLR模型的結(jié)果Tab.7 Results of PLS and MLR models based on different wavelength extraction methods

4 結(jié)論

本文以靈武長(zhǎng)棗為研究對(duì)象，采集寧夏靈武長(zhǎng)棗400～1 000 nm的光譜圖像，提取反射光譜，同時(shí)利用HPLC測(cè)量長(zhǎng)棗中的葡萄糖含量，對(duì)光譜值和化學(xué)值建立PLSR、MLR模型。采用高光譜成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)靈武長(zhǎng)棗葡萄糖含量的預(yù)測(cè)。主要結(jié)論如下：

(1)對(duì)原始光譜采用6種方法進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)對(duì)比分析數(shù)據(jù)和圖像信息，確定SG(7)為最佳預(yù)處理方法，該預(yù)處理方法降低了噪音，去掉了無(wú)用信息，提高了建模效果，結(jié)果如下：Rc= 0.826 5，Rp=0.791 0，RMSEC為0.005 3 mg/g，RMSEP為0.005 6 mg/g；

(2)基于最優(yōu)預(yù)處理方法，使用了7種數(shù)據(jù)降維方法，提取特征波長(zhǎng)數(shù)分別為5，15，18，61，51，33，27，占到全波段的4%、12%、14.4%、48.8%、40.8%、26.4%、21.6%；

(3)對(duì)以上8種降維處理數(shù)據(jù)分別建立PLSR和MLR模型，PLSR-IRF+CARS為最優(yōu)模型，Rc=0.835 3，Rp=0.832 2，提取特征波長(zhǎng)可減少冗長(zhǎng)數(shù)據(jù)，降低維數(shù)，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。