李建玲,丁國(guó)華,劉艷萍，馮華杰,牛燕燕,何猛雄,史載鋒,何文英*

(1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158；2.熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；3.海南省水環(huán)境污染治理與資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158)

1 引言

1,2,3-三氮唑類化合物以其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)及良好的生物活性和低毒性，已在材料化學(xué)、藥物化學(xué)、有機(jī)化學(xué)和有機(jī)金屬化學(xué)等許多領(lǐng)域有諸多應(yīng)用，并愈發(fā)引起了研究者的興趣及對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用[1-2]。其中，利用其結(jié)構(gòu)中含氮五元雜環(huán)的特征，將其設(shè)計(jì)合成目標(biāo)產(chǎn)物來作為金屬離子探針就是一個(gè)非常有實(shí)際意義的應(yīng)用，尤其在醫(yī)藥學(xué)的測(cè)定藥理活性方面已顯示出其獨(dú)特的作用[3]。眾所周知，生物體中的金屬離子若不足或過量均可導(dǎo)致正常的生理功能紊亂，比如汞元素作為一種劇毒性的金屬污染物，沉入水中后可通過水生食物鏈快速累積，對(duì)生命體及環(huán)境水體造成威脅；進(jìn)入人體可引起消化道、腎臟、大腦或神經(jīng)系統(tǒng)等的多種疾病。近些年來，在眾多對(duì)汞離子的檢測(cè)方法中，較早的有冷蒸氣原子吸收光譜法[4]，現(xiàn)在利用新型熒光或顯色探針檢測(cè)汞離子已經(jīng)成為一種主要的研究方法[5-7]，通過修飾電極測(cè)定汞離子也有諸多報(bào)道[8-9]，最新的報(bào)道表明，具有生物活性的納米顆粒[10-11]和量子點(diǎn)材料[12-13]也可高效靈敏地檢測(cè)汞及其化合物。尤其是新開發(fā)合成1,2,3-三氮唑類化合物衍生物對(duì)某些金屬離子的特異識(shí)別，或充分利用其與金屬離子可結(jié)合的藥理活性,對(duì)深入研究新三氮唑類化合物具有重要的理論及實(shí)際意義。

由于羅丹明及其衍生物具有多種優(yōu)越的光譜特點(diǎn)，如良好的光穩(wěn)定性、寬廣的波長(zhǎng)范圍、較高的量子產(chǎn)率及摩爾消光系數(shù)大、對(duì)pH不敏感等優(yōu)點(diǎn)，及基于閉環(huán)到開環(huán)機(jī)理可表現(xiàn)出明顯熒光增強(qiáng)及顏色變化等，已在金屬離子的顯色識(shí)別方面有眾多應(yīng)用[14-15]。而基于三氮唑-羅丹明熒光探針的研究報(bào)道也揭示了這些探針均對(duì)Hg2+有相似的特異性響應(yīng)，主要表現(xiàn)為呈現(xiàn)粉紅色的顯色響應(yīng)、在中性pH值左右的水溶液中形成1∶1或1∶2的絡(luò)合物等[16-19]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究也發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)化合物對(duì)Hg2+有高選擇性顯色響應(yīng)，而本文設(shè)計(jì)的探針的優(yōu)勢(shì)尤其表現(xiàn)在pH=7.4的條件下，這可為進(jìn)一步開發(fā)其作為定性檢測(cè)生理?xiàng)l件下的金屬離子探針提供科學(xué)合理的指導(dǎo)。

根據(jù)1,2,3-三氮唑類化合物的5-苯基-結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本文對(duì)2-(4-甲氧基)-2H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸乙酯(EMPC)[20]進(jìn)行了量子化學(xué)參數(shù)及光活性的理論計(jì)算；并有針對(duì)性地設(shè)計(jì)合成路線，篩選其羅丹明合成產(chǎn)物REMPC對(duì)金屬離子的識(shí)別性能及鍵合機(jī)理；通過細(xì)胞成像測(cè)定顯示REMPC可實(shí)現(xiàn)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的標(biāo)記，借此發(fā)現(xiàn)這種新化合物的性質(zhì)及用途。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

測(cè)試儀器有：400MHz AV400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國(guó)Bruker公司)；U3900/3900H紫外可見光分光光度計(jì)(日本日立公司)；F-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；Nikon TS100-F倒置熒光顯微鏡(日本尼康)；MCO-15A型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO)；SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)(蘇潔凈化)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)；Agilent 1100-Bruker Esquire HCT質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司-德國(guó)Bruker公司離子質(zhì)量分析器)。

5-苯基-2-(4-甲氧基)-2H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸乙酯 (EMPC)由海南師范大學(xué)有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)室提供；羅丹明B(AR)購(gòu)自西亞試劑，水合肼(80%，AR)購(gòu)自阿拉丁試劑，金屬離子(1 000 μg/mL)購(gòu)自Inorganic Ventures公司；人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞由海南師范大學(xué)熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)所用其余試劑、溶劑均為市售分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 合成路線及方法

2.2.1 羅丹明酰肼1的合成

參考文獻(xiàn)[21]，將羅丹明B(1.0 g,2.1 mmol)和20 mL無水乙醇加入50 mL圓底燒瓶中，混勻后緩慢滴加水合肼(2 mL，80%)，回流加熱3 h。冷卻至室溫后，用50 mL乙酸乙酯和50 mL水萃取，將有機(jī)相倒入錐形瓶中，用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到粉紅色固體1 (0.52 g,54.74%)。m.p.166～168 ℃[8]。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ(10-6)=1.16(t,J=6.8 Hz,12H),3.34(q,J=7.2 Hz,8H),3.61(s,2H),6.30(m,2H),6.45(m,4H),7.1(m,J=2.64 Hz,1H),7.44(m,2H),7.94(m,1H);13CNMR(100 MHz,CDCl3)δ(10-6)=166.0,153.8,151.4,148,8,132.4,129.9,128.0,127.9,123.7,122.8,107.9,104.5,97.9,77.3,77.0,76.7,65.8,44.2,12.5。

2.2.2 化合物REMPC的合成

在25 mL圓底燒瓶中加入 EMPC(68 mg,0.21 mmol)，加入5 mL乙醇和5 mL水，再加入KOH固體(60 mg,1.07 mmol)，室溫下攪拌4 h，再加熱回流2 h。冷卻至室溫后，用濃鹽酸將反應(yīng)液的pH值調(diào)到1以下。然后用乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上除去有機(jī)溶劑，得到白色固體2。再將3 mL二氯亞砜加入裝有固體2的圓底燒瓶中，90 ℃回流3 h，之后將回流裝置改為蒸餾裝置，蒸出多余的二氯亞砜，得到化合物3。繼續(xù)向上述圓底燒瓶中加入10 mL二氯甲烷，待溶解后，加入羅丹明酰肼1(93 mg,0.20 mmol)，再加入1 mL乙二胺，混合溶液在室溫下攪拌12 h后，加入乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相中加入無水硫酸鈉干燥，旋干除去溶劑，得到粗產(chǎn)物，利用柱層析分離提純粗產(chǎn)物，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯(4∶1,V∶V)，最后得到產(chǎn)物REMPC(78.8 mg，52.09%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ8.08(s,1H),8.00(d,J=7.0 Hz,1H),7.91(d,J=9.0 Hz,2H),7.85(d,J=3.7 Hz,2H),7.57～7.50(m,2H),7.32(d,J=5.5 Hz,3H),7.19(d,J=7.2 Hz,1H),6.94(s,1H),6.92(s,1H),6.76(d,J=9.4 Hz,2H),6.36(m,4H),3.82(s,3H),3.32(dd,J=13.3,6.4 Hz,8H),1.14(t,J=6.9 Hz,12H);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ165.0,159.6,158.4,153.8,151.3,149.2,148.9,136.9,133.1,132.8,129.5,129.4,129.0,128.9,128.3,128.0,124.2,123.5,120.7,114.3,108.0,104.6,97.7,77.3,77.0,76.7,66.3,55.5,44.3,29.6,12.5.HRMS(ESI)(m/z):[M+H]+calcd for C44H44N7O4,734.345 5;found,734.345 4。

2.3 EMPC的結(jié)構(gòu)計(jì)算

采用GaussView5.0量化程序及密度泛函理論DFT的兩種方法(CIS/6-31G(d)和B3LYP/6-31G(d))在6-311G(d)基組下對(duì)EMPC進(jìn)行基態(tài)全優(yōu)化；并用含時(shí)密度泛函 TD-DFT對(duì)EMPC的最低激發(fā)態(tài)的構(gòu)型進(jìn)行全優(yōu)化及計(jì)算EMPC的吸收光譜；再將B3LYP/6-311G(d)計(jì)算所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行基態(tài)軌道分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行TD-DFT計(jì)算熒光光譜。再用B3LYP/6-311G(d)，B3LYP/6-311G+(d)方法計(jì)算EMPC的各種電離勢(shì)及電子親和勢(shì)[22-23]。最后利用Gaussian 09量化程序的B3LYP方法分別在 6-311G(d)基組下對(duì)REMPC中H、C、N、O 和F及在LANL2TZ 基組下對(duì) Hg進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和能量計(jì)算[24]。

2.4 光譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.018 4 g化合物REMPC，用乙腈溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成5×10-4mol·L-1的儲(chǔ)備液，用超純水將15種金屬離子(Pb2+、Mn2+、K+、Na+、Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+、Hg2+、Li+和 Mg2+)配制成5×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液。測(cè)定熒光光譜時(shí)，固定激發(fā)波長(zhǎng)為 563 nm，在比色管中加入一定體積的REMPC儲(chǔ)備液，用DMF-水(V∶V=1∶1,Tris-HCl,pH=7.4)定容，使其濃度為1×10-5mol·L-1，再分別滴加不同的金屬離子,掃描每次滴加后體系的光譜曲線，測(cè)定波長(zhǎng)范圍為565～750 nm，激發(fā)光譜狹縫及發(fā)射光譜狹縫均為5 nm，發(fā)射光譜的掃描速度設(shè)置為“Fast”模式。

測(cè)定紫外光譜時(shí)，比色管中固定化合物REMPC的濃度為5×10-5mol·L-1，向體系中連續(xù)滴加金屬離子，測(cè)定波長(zhǎng)范圍為400～750 nm。

2.5 質(zhì)譜測(cè)定

質(zhì)譜制定在Agilent 1100-Bruker Esquire HCT質(zhì)譜儀進(jìn)行，參數(shù)設(shè)置：Capilary:46 nA，Nebulizer:12.0 psi，Dry Gas:10.0 L/min，Dry Temp:300 ℃，Ion Source Type:ESI，Scan Begin:50m/z，Scan End:1 500m/z。

2.6 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)及成像測(cè)試

在37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞12 h；移去6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS溶液沖洗3遍；分別加入2 000 μL乙醇及40 μL REMPC，再孵育30 min，在倒置型激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行成像；繼續(xù)加入8 μL Hg2+培養(yǎng)30 min，觀察其細(xì)胞顯色狀況，并成像，分別采集亮場(chǎng)和熒光。

3 結(jié)果與討論

3.1 EMPC的結(jié)構(gòu)及光譜分析

圖1 (a)優(yōu)化的EMPC結(jié)構(gòu)；(b)EMPC基態(tài)的LUMO前線分子軌道；(c)EMPC基態(tài)的HOMO前線分子軌道。Fig.1 (a)Optimized structure of EMPC.(b)Frontier molecular orbital of ground state on LUMO.(C)Frontier molecular orbital of ground state on HOMO.

圖2 (a)EMPC的熒光發(fā)射光譜(曲線a為發(fā)射光譜、b為激發(fā)光譜)；(b)EMPC的吸收光譜。圖中的插圖為EMPC在甲醇中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果。Fig.2 Fluorescence emission spectra of EMPC(a)and absorption spectra of EMPC(b).The illustrations are the corresponding spectra of EMPC measured in methanol.

基于以上結(jié)果，理論計(jì)算與實(shí)驗(yàn)所得的光譜性質(zhì)在較大程度上是相吻合的，均證明了溶劑效應(yīng)及EMPC具有良好的光譜特征，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(未列出),獲得EMPC在甲醇中的吸光系數(shù)為5.262×104L·mol-1·cm-1，可為進(jìn)一步研發(fā)EMPC作為新型發(fā)光材料及分析測(cè)定其含量或者設(shè)計(jì)成新型藥物奠定一定的科學(xué)基礎(chǔ)。

3.2 REMPC與羅丹明B的合成、表征及結(jié)構(gòu)計(jì)算

理論上，含酯基的有機(jī)化合物能與羅丹明酰肼合成相應(yīng)的衍生物[32]，由于5-苯基-2-(4-甲氧基)-2H-1,2,3-三氮唑-4-羧酸乙酯(EMPC)的結(jié)構(gòu)中含有酯基，通過設(shè)計(jì)合成路線及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，成功地合成了REMPC的目標(biāo)產(chǎn)物，并通過1H NMR、13C NMR和 HRESI-MS方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征。結(jié)果表明其分子離子峰位于734.345 4，與REMPC(C44H44N7O4)的理論分子量734.345 5非常接近，這可為具有相似1,2,3-三氮唑結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行羅丹明衍生物的合成提供合理的實(shí)例指導(dǎo)。

3.3 REMPC與金屬離子作用的熒光光譜

選擇15種金屬離子(Pb2+、Mn2+、K+、Na+、Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+、Hg2+、Li+和Mg2+)，在激發(fā)波長(zhǎng)為563 nm，分別測(cè)定REMPC與各金屬離子作用的熒光發(fā)射光譜(圖3(a))。圖3(a)顯示，無色的REMPC未出現(xiàn)明顯的發(fā)射峰；在加金屬離子時(shí)，只有Hg2+使得REMPC-Hg2+體系在584 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度顯著增大，但對(duì)其他金屬離子與Hg2+體系卻沒有明顯的熒光強(qiáng)度變化。圖3(b)為不同金屬離子在584 nm處相對(duì)熒光發(fā)射強(qiáng)度的對(duì)比，可看出在該濃度下，Hg2+的加入使得REMPC的熒光強(qiáng)度增大60倍，說明REMPC對(duì)Hg2+有很好的響應(yīng)。

圖3 REMPC-Hg2+ 體系的熒光光譜。(a)在DMF-H2O中(V∶V=1∶1,Tris-HCl,pH=7.4)，λex=563 nm，其他各金屬離子(50 μmol·L-1)存在下REMPC(10 μmol·L-1)的熒光光譜；(b)對(duì)應(yīng)的不同體系的584 nm處的熒光強(qiáng)度，其中插圖為不同體系溶液的照片。Fig.3 Fluorescence spectra of REMPC(a)and the fluorescence intensities of different systems(b).(a)REMPC(10 μmol·L-1)in DMF-H2O (V∶V=1∶1,Tris-HCl,pH=7.4)in the presence of various cations (4.67×10-5 mol·L-1)(λex=563 nm).(b)Fluorescence intensities of different systems at 584 nm，the illustration is photographs of the REMPC in the presence of Hg2+ and other metal ions.

圖3(b)中的插圖為在同一實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定其他各離子存在時(shí)的顯色照片，可見僅加入Hg2+時(shí)溶液顯肉眼可觀察到的粉紅色，其他金屬離子的加入均不使REMPC溶液顯色。這些結(jié)果表明，Hg2+的加入使得REMPC中羅丹明B結(jié)構(gòu)的螺環(huán)打開，發(fā)生粉紅色的顯色反應(yīng)，并且這種顯色僅對(duì)Hg2+有高選擇性[34]。為確定REMPC對(duì)Hg2+響應(yīng)的靈敏度，進(jìn)行了固定REMPC濃度(1×10-5mol·L-1)逐漸滴加Hg2+的熒光滴定實(shí)驗(yàn)(未列出)。結(jié)果表明在最大發(fā)射波長(zhǎng)為584 nm處，Hg2+的濃度在2.67～4.67×10-5mol·L-1范圍，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大，并與Hg2+濃度呈Boltzmannd的線性關(guān)系(R2=0.993 1)；但當(dāng)Hg2+濃度超過4.67×10-5mol·L-1時(shí)，體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且漸有降低趨勢(shì)。利用公式3σ/k得到REMPC對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為9.665×10-8mol·L-1。

3.4 REMPC與金屬離子作用的紫外光譜分析

為輔助說明REMPC對(duì)Hg2+有高選擇性的熒光光譜結(jié)果，進(jìn)行了紫外光譜分析[32]。在DMF-水(V∶V=1∶1,Tris-HCl,pH=7.4)溶液中，分別測(cè)定了REMPC (5×10-5mol·L-1)與不同金屬離子(濃度均為5×10-5mol·L-1的Pb2+、Mn2+、K+、Na+、Ag+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+、Hg2+、Li+和Mg2+)作用的紫外光譜(未列出)，無色的REMPC未出現(xiàn)明顯的吸收峰；在加金屬離子時(shí)，只有Hg2+使得REMPC- Hg2+體系在565 nm處出現(xiàn)最大吸收峰，并伴隨粉紅色的溶液出現(xiàn)，但對(duì)其他金屬離子與Hg2+體系卻沒有明顯的吸收強(qiáng)度和顏色的變化。這表明，僅Hg2+的存在會(huì)使得REMPC螺環(huán)中羅丹明B結(jié)構(gòu)的螺環(huán)從閉環(huán)到開環(huán)狀態(tài)[25]，與熒光分析的結(jié)果相吻合[32]。

Hg2+對(duì)REMPC的紫外滴定結(jié)果(未列出)表明，在最大吸收峰565 nm處，Hg2+濃度在2.00×10-5～4.67×10-5mol·L-1內(nèi)，與體系吸光度及Hg2+濃度呈Boltzmannd的線性關(guān)系(R2=0.999 9，未列出)，但當(dāng)Hg2+濃度大于4.67×10-5mol·L-1時(shí)，體系的吸光度隨Hg2+濃度升高而呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，表明Hg2+與REMPC的相互作用可能達(dá)到了飽和狀態(tài)。

3.5 干擾離子實(shí)驗(yàn)

在DMF-H2O (V∶V=1∶1,Tris-HCl,pH=7.4)溶液中，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為584 nm，有其他金屬離子共存時(shí)對(duì)REMPC測(cè)定了Hg2+的干擾結(jié)果(未列出)。結(jié)果表明，REMPC-Hg2+體系的熒光強(qiáng)度并沒有受到其他離子共同存在的干擾，說明REMPC對(duì)Hg2+的顯色響應(yīng)比其他離子更為靈敏，具有特異性的結(jié)合作用。

3.6 REMPC對(duì)Hg2+的響應(yīng)時(shí)間

通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定了0～60 min時(shí)間范圍內(nèi)REMPC與Hg2+作用時(shí)的熒光強(qiáng)度(未列出)，REMPC與Hg2+體系在3 min內(nèi)可達(dá)到穩(wěn)定，并在60 min內(nèi)維持穩(wěn)定，說明利用REMPC的顯色反應(yīng)可在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)快速、靈敏、定性地測(cè)定Hg2+。

3.7 確定REMPC與Hg2+的絡(luò)合比

通過等摩爾連續(xù)變化法測(cè)定REMPC與Hg2+的絡(luò)合比[31-32]。固定REMPC和Hg2+的總濃度為5×10-5mol·L-1，變化REMPC與Hg2+離子的濃度比，獲得不同比值下體系的熒光強(qiáng)度并制作工作曲線(圖4(a)所示)，可得出REMPC與Hg2+以1∶2的形式進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)。同時(shí)，為佐證該結(jié)果，利用Gaussian 09量化程序的相關(guān)基組對(duì)REMPC進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化(圖4(b))和能量計(jì)算(未列出)。圖4(b)顯示，REMPC的結(jié)構(gòu)空間可包容2個(gè)Hg2+，且能與不同基團(tuán)中的O或N生成2個(gè)穩(wěn)定的五元環(huán)。計(jì)算結(jié)果也表明，REMPC與Hg2+的絡(luò)合比為1∶2時(shí)，其能量變化值(ΔE(a.u.)及ΔE(eV)分別為-0.57和-15.62)比形成1∶1的要小(對(duì)應(yīng)值為-0.45和-12.32)。以上實(shí)驗(yàn)及理論計(jì)算結(jié)果均說明，REMPC與2個(gè)Hg2+的絡(luò)合更穩(wěn)定。

圖4 (a)REMPC與Hg2+的工作曲線；(b)優(yōu)化的REMPC與2個(gè)Hg2+ 鍵合的結(jié)構(gòu)。Fig.4 (a)Job plot of REMPC with Hg2+ ion.(b)Optimized structure of REMPC binding to two of Hg2+ ions.

3.8 REMPC與Hg2+顯色機(jī)制

一般情況下，金屬離子引起羅丹明衍生物的響應(yīng)機(jī)制有配位型熒光探針、反應(yīng)型熒光探針及配位開環(huán)再進(jìn)一步催化酰胺鍵的水解3種方式。特別是反應(yīng)型熒光探針，通過羅丹明衍生物和金屬離子發(fā)生不可逆化學(xué)反應(yīng)，作用于內(nèi)酰胺螺環(huán)發(fā)生水解反應(yīng)或催化環(huán)化等，引發(fā)羅丹明螺環(huán)開環(huán)，從而恢復(fù)其熒光，表現(xiàn)為體系熒光增強(qiáng)，多用于設(shè)計(jì)off-on型熒光探針[35-36]。

為確定REMPC對(duì)Hg2+的顯色機(jī)理，測(cè)定了正離子模式下REMPC-Hg2+體系的電噴霧質(zhì)譜(圖5(a))，圖5(b)為理論計(jì)算的結(jié)果?？煽闯觯趍/z900～1 400范圍內(nèi)，出現(xiàn)位于m/z1 135.9的最強(qiáng)離子峰，可歸屬于[REMPC+2Hg+2H]，即REMPC與2個(gè)Hg2+的絡(luò)合形式。圖5(b)的理論模擬效果圖顯示了最高峰值為1 135.9及相應(yīng)的同位素模式，也明顯可見模擬圖與實(shí)測(cè)圖的吻合度較高，以上結(jié)果均證明REMPC可與Hg2+形成1∶2的穩(wěn)定絡(luò)合物，并進(jìn)一步補(bǔ)充佐證了用等摩爾連續(xù)變化法得到的光譜實(shí)驗(yàn)及結(jié)構(gòu)計(jì)算測(cè)定絡(luò)合比結(jié)果的合理性。

圖5 在有少量Cl-存在時(shí)REMPC的ESI-MS 圖。(a)和(b)分別為實(shí)驗(yàn)和理論計(jì)算的結(jié)果，其中的兩個(gè)插圖分別對(duì)應(yīng)[REMPC+2Hg+H]的同位素模式圖。Fig.5 (a)ESI-MS of REMPC in the presence of Hg2+and trace amounts of Cl-.Inset:enlarged patterns for the [REMPC+2Hg+H].(b)Calculated ESI-MS of REMPC in the presence of Hg2+and Cl-.Inset:calculated isotopic patterns for the [REMPC+2Hg+H].

結(jié)合本文中的所有光譜及計(jì)算結(jié)果可以確定，新化合物REMPC屬羅丹明類反應(yīng)型熒光探針。圖6為REMPC與Hg2+可能的顯色作用機(jī)制，EMPC的三氮唑基團(tuán)誘導(dǎo)羅丹明B的螺環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生閉環(huán)，導(dǎo)致合成產(chǎn)物REMPC沒有熒光強(qiáng)度顯示；當(dāng)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為563 nm，Hg2+存在時(shí)，1個(gè)分子的REMPC可與2個(gè)分子的Hg2+相互作用，使得羅丹明B的螺環(huán)開環(huán)，體系在584 nm處有最大熒光發(fā)射強(qiáng)度，EMPC單體三氮唑的N與其羧基的C及O原子與一個(gè)Hg2+形成五元環(huán)；羅丹明B結(jié)構(gòu)的酰胺上的2個(gè)N及鄰近的羰基O原子與另一個(gè)Hg2+形成五元環(huán)，并伴隨體系的熒光強(qiáng)度增大，同時(shí)肉眼可觀察到溶液從無色變?yōu)榉奂t色。結(jié)合本研究的光譜測(cè)定條件(pH=7.4)及高選擇性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明REMPC是一種可以在生理?xiàng)l件下定性測(cè)定Hg2+的理想探針。

圖6 REMPC對(duì)Hg2+的響應(yīng)機(jī)制推測(cè)Fig.6 Proposed recognition mechanism of REMPC towards Hg2+

3.9 REMPC在HeLa細(xì)胞中的成像研究

為進(jìn)一步確定探針分子在生物體內(nèi)的應(yīng)用潛質(zhì)，測(cè)試了REMPC在人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞中的成像(圖7)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅有FBS培養(yǎng)液及REMPC存在時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無熒光(分別對(duì)應(yīng)圖7(1b)及7(2b))，而當(dāng)REMPC和Hg2+共同孵育細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有明顯的熒光出現(xiàn)(圖7(3b))，不僅表明在細(xì)胞中REMPC對(duì)Hg2+有選擇性響應(yīng)，也顯示REMPC有可能被開發(fā)用于生物細(xì)胞內(nèi)的Hg2+的檢測(cè)。

圖7 REMPC在HeLa細(xì)胞中對(duì)Hg2+的成像。(1a～3a)亮場(chǎng)成像；(1b)在FBS培養(yǎng)液下HeLa細(xì)胞的熒光成像；(2b)L4探針在HeLa細(xì)胞的熒光成像；(3b)L4探針在HeLa細(xì)胞對(duì)Hg2+的熒光成像。
Fig.7 Fluorescence imaging of Hg2+in HeLa cell with REMPC.(1a)-(3a)Brightfield transmission images.(1b)Images of cells incubated with the FBS culture solution as the sample blank.(2b)Images of cells incubated with REMPC(10 μmol·L-1).(3b)Images of cells incubated with REMPC(10 μmol·L-1)and Hg2+(20 μmol·L-1).

5 結(jié)論

本文首先利用量子化學(xué)計(jì)算了一種含酯基1,2,3-三氮唑化合物EMPC的結(jié)構(gòu)特征及光活性參數(shù)，理論計(jì)算與光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致；并將其設(shè)計(jì)與羅丹明B合成了一種新型衍生物REMPC，熒光光譜及紫外光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明在pH=7.4的水溶液條件下REMPC對(duì)Hg2+有高選擇性響應(yīng)，溶液顏色由無色變?yōu)榉奂t色，反應(yīng)速率很快，生成1∶2的穩(wěn)定絡(luò)合物，不受其他共存金屬離子的干擾。推測(cè)可能的反應(yīng)機(jī)制為：EMPC介入生成的REMPC可調(diào)節(jié)羅丹明B從閉環(huán)到開環(huán)過程，表明REMPC具有構(gòu)建off-on型熒光探針的潛能，并可以在生理?xiàng)l件下快速、靈敏、定性地測(cè)定Hg2+，這為深入研究1,2,3-三氮唑及其衍生物的理化性質(zhì)或應(yīng)用提供了一定的有價(jià)值信息。