賴金甜， 李相新， 鄭芬， 黃振強， 譚汝宏

佛山市婦幼保健院檢驗科(廣東佛山 528000)

人巨細胞病毒(HCMV)是一種皰疹病毒科β亞科的具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA病毒[1]，基因結(jié)構(gòu)復雜，堿基長度較長，屬于條件致病病毒，主要易發(fā)生在免疫功能低下的機體中，特別是身體機能正在發(fā)育和免疫力低下的嬰幼兒，并且容易繼發(fā)細菌或真菌的感染，大大增加了治療的難度，導致嬰幼兒的死亡率大大提高，嚴重威脅嬰幼兒患者的生命健康[2]。由于巨細胞病毒(CMV)具有組織和細胞的泛嗜性，因此在臨床上的表現(xiàn)各異，主要會引發(fā)泌尿生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟、血液循環(huán)系統(tǒng)等并發(fā)癥，其中以并發(fā)肺炎最為常見[3]。我國是CMV感染的高發(fā)區(qū)域，有研究[4-5]發(fā)現(xiàn)在我國健康人群IgG抗體檢測中，CMV的陽性感染率高于70%，而孕產(chǎn)婦CMV的感染率更是高達90%，同時，3歲以下嬰幼兒的感染率也是高達80%，若嬰幼兒CMV合并肺炎患者無法得到及時準確的診斷和治療，則會導致病程發(fā)展迅速，病情兇險，危及生命，因此，尋找臨床上的一種快速準確的檢驗方法對檢測嬰幼兒CMV感染并及時采取救治，具有非常重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年10月到2018年8月在我院接受治療的嬰幼兒CMV合并肺炎感染的患兒89例，年齡為3個月至3歲，平均(2.1±0.2)歲，其中男童48例，女童41例；同時選擇在我院體檢的健康嬰幼兒83例作為健康對照組，男童43例，女童40例，年齡為0～3歲，平均(2.2±0.1)歲。診斷標準：(1)發(fā)熱并且持續(xù)3 d以上體溫>38℃；(2)呼吸困難、唇面紫紺、無痰性咳嗽、胸悶等；(3)胸片有間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)；(4)關(guān)節(jié)痛；(5)胃腸道潰瘍、出血等；(6)具備以上臨床表現(xiàn)，排除其他微生物或病原體感染。經(jīng)檢驗CMV-IgM和(或)CMV-DNA陽性者可診斷為CMV合并肺炎患兒。兩組患者在年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲得我院倫理委員會批準，所有納入研究的嬰幼兒均獲得其監(jiān)護人的同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本收集 抽取空腹受試者的靜脈血2 mL，室溫靜置1 h后，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，分離血清進行檢測。

1.3 檢測方法 化學發(fā)光法：通過羅氏Cobase601電化學發(fā)光分析儀及其原裝試劑，嚴格按照說明書進行操作，其中IgM檢測結(jié)果以Index>0.50為陽性感染。熒光定量PCR法：采用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀和中山大學達安基因股份有限公司的試劑盒檢測CMV-DNA，其中以CMV-DNA≥1×103拷貝/mL為陽性。同時，利用ELISA試劑盒(均來自武漢華美生物基因工程有限公司)檢測血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的表達含量，輔助對CMV合并肺炎嬰幼兒患者的檢測。

2 結(jié)果

2.1 CMV-DNA和CMV-IgM檢測結(jié)果 在89例CMV陽性嬰幼兒患者中，血清CMV-IgM陽性的有77例，血清中CMV-DNA陽性的有81例，雙陽性的有73例，雙陰性的有4例，血清中CMV-DNA陽性而CMV-IgM陰性的有8例，而血清中CMV-IgM陽性而CMV-DNA陰性的有4例。

2.2 兩組血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比較 CMV合并肺炎陽性患兒血清中IFN-γ的含量明顯高于健康對照組，而血清中IL-4和IL-6的含量明顯低于健康對照組，其組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量比較

組別例數(shù)IFN-γIL-4IL-6CMV患兒8986.96±7.29*28.49±6.61*34.62±6.53*健康對照組8321.27±4.7658.39±10.0379.47±9.11

*與健康對照組比較P<0.05

2.3 早期診斷分析 多種方法聯(lián)合檢測CMV感染合并肺炎的敏感度為95.5%，特異度為91.6%，準確率為96.2%。見表2和圖1。

表2 兩組患者血清中CMV-DNA聯(lián)合IFN-γ、IL-4和IL-6的早期診斷分析 %

圖1 多種方法聯(lián)合檢測嬰幼兒CMV感染合并肺炎的早期診斷ROC曲線分析

3 討論

CMV感染在大多數(shù)人一生的不同時期都可能會發(fā)生，與性別、年齡、生活環(huán)境、社會因素和經(jīng)濟條件等多種因素都有一定的相關(guān)性[6-7]。作為免疫力低下的群體代表之一，嬰幼兒是最容易受到CMV感染的，且CMV感染的同時，往往會影響到消化、呼吸、血液系統(tǒng)等，從而導致嬰幼兒營養(yǎng)不良、肺炎、肝功能損害、腎臟損害和血液系統(tǒng)疾病等，并且對器官造成不可逆的損傷，大大提高了病死率，威脅著患兒的生命健康[8]。研究顯示，0～1周歲嬰兒CMV陽性感染率高達80%，一旦機體免疫功能低下，就可以直接誘發(fā)巨細胞病毒的活化，引起活動性感染，其中在嬰幼兒患者中，最為常見的就是CMV合并肺炎[4]。由于對CMV肺炎早期缺乏特異性的檢測指標，很容易會導致誤診，致使病情延誤；同時，由于CMV具有泛嗜性，可以在免疫力低下的患者中引起多個器官的病變，且臨床表現(xiàn)各異[4]，無法進行有效的鑒別診斷，嚴重影響了嬰幼兒患者得到及時有效的救治，危害了嬰幼兒患者的健康安全[9]。因此，尋找一種更為快速準確的早期檢測手段和檢測指標成為了臨床研究的熱點。

當機體感染CMV后，就會出現(xiàn)特異性的IgM、IgG、IgE、IgA等抗體，其中，當CMV潛伏期感染10 d后即可在血清中檢測出特異性IgM抗體，而6周左右其抗體水平即可達到峰值，12～16周時，抗體消失[4]。因此，血清中IgM、IgG抗體的檢測結(jié)果呈現(xiàn)陽性，可以間接表示機體出現(xiàn)了CMV感染，或潛伏的CMV感染被活化或近期發(fā)生了CMV活動性感染，可見IgM、IgG是鑒別診斷CMV活動性感染的重要指標[10]。目前，主要通過實驗室病毒培養(yǎng)及病理鑒定HCMV感染作為主要的診斷方法和標準，但這種方法主要是觀察細胞病理學變化，檢測周期較長，無法實現(xiàn)臨床的快速檢測，而臨床上多采用ELISA法、化學發(fā)光法、膠體金法和熒光定量PCR法進行檢測[11-13]?；瘜W發(fā)光法是一種分子發(fā)光光譜分析法，主要利用儀器對體系化學發(fā)光強度的檢測，從而確定待測物含量的一種痕量分析方法，可以對IgM、IgG抗體水平進行定量檢測，而且整個過程均由儀器完成，極大程度地避免了操作者、環(huán)境等外界因素對檢測過程和結(jié)果判斷的誤差，對于IgM、IgG抗體陽性的檢出率、敏感度、特異度均明顯優(yōu)于ELISA法和膠體金法，適用于臨床大樣本的初檢。本研究中，對89例CMV陽性患兒進行檢測，血清CMV-IgM陽性的有77例，而血清中CMV-IgM陰性的有12例，陽性檢出率為86.51%，準確率為87.2%，雖然陽性檢出率較高，但仍有一定程度的誤差。因此，本研究結(jié)合熒光定量PCR法來檢測血清中CMV-DNA，以期提高對CMV感染診斷的準確率。熒光定量PCR法是檢測特異度和敏感度較高，且可以在低病毒含量下進行有效檢測的一種技術(shù)，具有極高的臨床應用價值，是診斷CMV感染較為敏感的方法之一[14-16]。本研究利用熒光定量PCR對89例CMV陽性患者進行檢測，其中CMV-DNA陽性的有81例，而CMV-DNA陰性的有4例，陽性檢出率為91.01%，準確率為89.5%，與對血清中CMV-IgM的檢測相比，一定程度上提高了對CMV感染檢測的準確率。

此外，研究表明[17-18]，當機體受到CMV感染后會出現(xiàn)的免疫紊亂的情況，而其機制非常復雜，目前主要認為與機體內(nèi)細胞因子的作用和失衡具有密不可分的關(guān)系。細胞因子是一類小分子多肽類物質(zhì)，是由免疫細胞分泌，并對細胞功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，一旦細胞因子水平發(fā)生失衡，則表明機體免疫功能出現(xiàn)了紊亂。機體內(nèi)Th1和Th2細胞是免疫細胞主要的分化形式，Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-β等因子，介導了細胞毒性和炎癥反應，而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等因子，主要通過刺激B細胞分泌大量免疫蛋白，參與體液免疫反應[19]。因此，常常檢測IFN-γ、IL-4和IL-6的含量來反映機體的免疫應答狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，CMV合并肺炎陽性患者血清中IFN-γ的含量明顯高于健康對照組(P<0.05)，經(jīng)統(tǒng)計分析后得到診斷的準確率為72.6%，閾值為95.0 pg/mL，而血清中IL-4和IL-6的含量明顯低于健康對照組(P<0.05)，兩個指標診斷的準確率分別為75.6%和67.6%，閾值分別為35.05 pg/mL和51.75 pg/mL，但統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)IL-6的含量檢測并不具有統(tǒng)計學意義，因此后續(xù)不納入聯(lián)合檢測內(nèi)。

綜上所述，通過ELISA法檢測血清中IFN-γ、IL-4和IL-6的含量變化，與化學發(fā)光法、熒光定量PCR法的檢測結(jié)果相結(jié)合，可以更加準確地判斷機體是否發(fā)生了CMV活動性感染，對于早期快速準確診斷CMV感染合并肺炎具有非常重要的指導意義。但本研究中臨床樣本量只有89例，樣本量較少，其檢測結(jié)果可能會存在一定程度的偏差，代表性不夠，之后的研究將會加大臨床樣本的收集和檢測，以期提高聯(lián)合檢測的準確度和可信度。