魯文雪，趙瑩，孫亞楠，曲桂武*，吳長景

1.濱州醫(yī)學(xué)院 抗衰老研究所，山東 煙臺 264003；2.周口師范學(xué)院，河南 周口 466001

羥基氰苷是一類苷元中含有氰基的氧苷類化合物，根據(jù)氰基相對于氧苷鍵的位置，又將這類化合物分為α-羥基腈苷和γ-羥基腈苷兩類。其中α-羥基腈苷易被β-葡萄糖苷酶或稀酸催化水解，生成的α-羥基腈苷元很不穩(wěn)定，會(huì)繼續(xù)分解為醛(酮)和氫氰酸，而γ-羥基腈苷則不會(huì)發(fā)生這類反應(yīng)[1]。

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate是從薔薇科珍珠梅屬植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun中分離得到的一個(gè)γ-羥基腈苷化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。我們曾報(bào)道過該化合物能顯著抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子NO的釋放水平[2]。由于該化合物分子中的氰基屬γ-羥基腈結(jié)構(gòu)，難以被酶或酸催化水解[3]，因此具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎藥理活性與化學(xué)穩(wěn)定性特點(diǎn)，使其具有潛在的藥用研究價(jià)值。

圖1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate化學(xué)結(jié)構(gòu)

關(guān)于Sutherlandin-5-cis-p-coumarate抗炎活性的進(jìn)一步研究有待進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)通過對二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)管通透性增加實(shí)驗(yàn)、醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)和小鼠熱板實(shí)驗(yàn)[4-8]，確認(rèn)Sutherlandin-5-cis-p-coumarate腹腔注射時(shí)的抗炎、鎮(zhèn)痛活性，為其進(jìn)一步的成藥性研究提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由濟(jì)南鵬悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(魯)20140007。

1.2 藥品與試劑

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對照品(實(shí)驗(yàn)室自制，無色針狀結(jié)晶，1H-NMR與13C-NMR光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[2]相符)；珍珠梅采自青島市黃島區(qū)太行山小區(qū)院內(nèi)，經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院抗衰老研究所曲桂武副教授鑒定為薔薇科植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun的地上部位；層析硅膠(100～200目，黃?；瘜W(xué)試劑公司)；醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：160337)；阿司匹林(石藥集團(tuán)，批號：018171287)；伊文思藍(lán)(中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：871225)；水為Milli-Q超純水。羧甲基纖維素鈉(規(guī)格：20 g·L-1水溶液，黏度為500～800 mPa·s)與其他試劑均為分析純，中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

2545B型制備色譜儀(美國Waters)；YMC-Actus C18制備型反相色譜柱(50 mm×20 mm，5 μm，日本YMC)；Thermo Fisher UltiMate3000高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex)；電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；UV-2600型紫外分光光度計(jì)(日本島津株式會(huì)社)；YLS-6B型智能熱板儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司)；KQ-50B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph)。

2 方法

2.1 供試品制備

取珍珠梅藥材，粉碎后用乙醇回流提取。收集提取液，按參考文獻(xiàn)[2]所述方法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、反相制備色譜處理，即得無色針狀Sutherlandin-5-cis-p-coumarate結(jié)晶。

2.2 樣品溶液制備

分別精密稱取Sutherlandin-5-cis-p-coumarate及研磨成粉末的醋酸潑尼松和阿司匹林適量，加入5%的羧甲基纖維素鈉溶液，超聲混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg·mL-1的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate混懸液，質(zhì)量濃度為0.15 mg·mL-1的醋酸潑尼松混懸液，質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1的阿司匹林混懸液。

2.3 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，分別為空白對照組(5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃組)，醋酸潑尼松組，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的高、中、低劑量組。每組每天灌胃給藥1次，每次0.4 mL，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h后，在各組小鼠右耳正反面涂抹0.1 mL二甲苯致炎，左耳不做處理。30 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下左右兩只耳片，用8 mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，立即精密稱質(zhì)量，并按公式(1)和(2)計(jì)算每只小鼠的耳廓腫脹度和腫脹抑制率[9-10]。

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

(1)

腫脹抑制率=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%

(2)

2.4 對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3項(xiàng)下方法分組與給藥，并在末次給藥1 h后，給予各組每只小鼠尾靜脈注射0.5%的伊文思藍(lán)0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，隨即腹腔注射0.7%的冰醋酸溶液0.2 mL，30 min后脫頸處死小鼠，腹腔注射5 mL 0.9%氯化鈉溶液，輕揉小鼠腹部，打開腹腔，收集腹腔洗液，3000 r·min-1離心10 min，取上清液，于590 nm波長下測其吸光度值(A)，按公式(3)計(jì)算滲出抑制率[11]。

(3)

2.5 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3項(xiàng)下方法分組與給藥(以阿司匹林為陽性對照)，并在末次給藥1 h后，每只腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2 mL，記錄每只小鼠在20 min內(nèi)的扭體次數(shù)，按公式(4)計(jì)算鎮(zhèn)痛率[12-13]。

鎮(zhèn)痛率=(空白對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/空白對照組扭體次數(shù)×100%

(4)

2.6 對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響

將智能熱板儀溫度調(diào)節(jié)至(55.0±0.5)℃，將小鼠置于其中，同時(shí)啟動(dòng)電子計(jì)時(shí)器，以小鼠開始舔后足或出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象所需的時(shí)間為痛閾值，共測2次，每次間隔30 min，取兩次結(jié)果的平均值作為該小鼠給藥前的正常痛閥值[14]。選取正常痛閥值在5～30 s的小鼠50只，雌雄各半，按2.3項(xiàng)下方法分組與給藥(以阿司匹林為陽性對照)，并于末次給藥后30、60、90 min，分別以熱板法測量各組小鼠的痛閾值，如60 s后仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計(jì)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用，高、中、低3個(gè)劑量的腫脹抑制率分別為72.42%、57.43%、27.70%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，腫脹抑制率高于或接近陽性對照組，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎消腫作用。

表1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個(gè)劑量組的滲出抑制率分別為60.87%、69.57%、19.56%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示高、中劑量的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎作用。

表2 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

3.3 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個(gè)劑量組的抑制率分別為63.05%、57.54%、35.81%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，抑制率與陽性對照相近，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸刺激引起的小鼠致疼反應(yīng)有抑制作用。

表3 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3.4 對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個(gè)劑量組在給藥30 min后的痛閥值明顯延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對小鼠因熱板刺激引起的疼痛具有抑制作用。

4 討論

珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun廣泛分布于云南、貴州、四川、甘肅、寧夏及東北，有活血祛瘀、消腫止痛的作用，主治跌打損傷、骨折、風(fēng)濕痹痛；苦、寒，有毒，歸肝、腎經(jīng)[13]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)主要報(bào)道了珍珠梅乙酸乙酯提取物的多種藥理活性[15-19]，但具體物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待闡明。我們曾報(bào)道在珍珠梅中發(fā)現(xiàn)的氰苷化合物，能夠抑制LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子NO的釋放水平。其中的α-羥基腈苷可在酶或稀酸作用下水解產(chǎn)生氫氰酸，由此可以解釋珍珠梅具有的毒性；而以Sutherlandin-5-cis-p-coumarate為代表的γ-羥基腈苷，由于具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性與藥理活性，則有望在珍珠梅的臨床應(yīng)用中扮演重要的角色。

本研究采用動(dòng)物模型考察了Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎鎮(zhèn)痛活性，并分別以醋酸潑尼松和阿司匹林為抗炎和鎮(zhèn)痛模型的陽性對照藥，所用劑量系根據(jù)人用劑量換算而來。所采用的4種模型，則是藥物抗炎、鎮(zhèn)痛活性研究的常用模型，其中二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型和醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加模型，均可產(chǎn)生局部血管擴(kuò)張及毛細(xì)血管通透性增加等炎癥的典型特征；腹腔注射醋酸可增加腹腔液中的前列腺素等致痛物質(zhì)，從而使外周痛覺神經(jīng)敏化，使小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)，而熱板法比化學(xué)刺激致小鼠扭體反應(yīng)更敏感，更能反映藥物的鎮(zhèn)痛活性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate經(jīng)灌胃給藥后，對二甲苯致小鼠耳廓腫脹和醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增加，以及對因醋酸刺激和因熱板刺激引起的小鼠疼痛反應(yīng)均具有不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，預(yù)示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate在抗炎鎮(zhèn)痛藥物研究領(lǐng)域具有潛在的價(jià)值，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

表4 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響