馬逢時，劉家水，談永進

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W校 藥學系，安徽 安慶 246052)

空心蓮子草(AlternantheraPhiloxeroides(Mart.) Griseb)為莧科蓮子草屬多年生宿根草本植物，主要分布于池沼水溝和潮濕地中，產(chǎn)于湖北、湖南、江蘇、浙江等省，曾收載于1977版《中國藥典》，主要有清熱解毒、涼血利尿之功效，臨床常用于治療病毒性疾病，如麻疹、流感等。植物化學研究顯示，空心蓮子草含黃酮類、三萜及其皂苷類、生物堿類、內(nèi)酰胺、氨基酸類等成分，具有抗病毒、保肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[1-9]。

空心蓮子草原產(chǎn)于巴西，自20世紀30年代引種至我國以來，因其較強的繁殖能力，現(xiàn)已遍布全國各地，逐漸演變成危害當?shù)剞r(nóng)作物生長、堵塞水道交通的害草，故關(guān)于其治理和控制研究較多，主要有機械防除、化學清理以及生物防治，如草葉甲、跳甲、病原菌等[10]。近年來，隨著我國對外來入侵生物的資源化和無害化利用認識的逐步加深，空心蓮子草的資源價值也逐漸被發(fā)掘，可在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及污染治理等領域得到較好的應用[10]。在醫(yī)藥領域，空心蓮子草注射液曾開發(fā)用于抗病毒治療，如流行性乙型腦炎早期，流行性出血熱初期，麻疹等，螃蜞菊及其制劑用于防治流行性感冒、病毒性肝炎、細菌性痢疾等[11-16]；在農(nóng)業(yè)領域，空心蓮子草可用于畜牧業(yè)做綠色基肥、豬羊飼料，可用于制作沼氣，可作為天然植物滅螺藥物，替代化學滅螺劑而減少污染；在污染治理領域，可用其處理富營養(yǎng)化水體，凈化工業(yè)污水，對于水體、土壤重金屬污染的治理效果較好[10]。基于對外來入侵生物化害為利、變廢為寶的資源化利用思路，本研究從空心蓮子草作為畜禽飼料的農(nóng)業(yè)價值出發(fā)，考察其營養(yǎng)功效相關(guān)的核苷類、氨基酸類成分的組成和含量，為其多途徑、多層次的綜合開發(fā)利用提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基酸類對照品：苯丙氨酸(Phe，1)、亮氨酸(Leu，2)、色氨酸(Trp，3)、異亮氨酸(Ile，4)、(-氨基丁酸(GABA，5)、甲硫氨酸(Met，6)、纈氨酸(Val，7)、脯氨酸(Pro，8)、?；撬?Tau，9)、酪氨酸(Tyr，10)、半胱氨酸(Cys，11)、丙氨酸(Ala，12)、羥脯氨酸(Hpro，13)、蘇氨酸(Thr，14)、谷氨酸(Glu，15)、賴氨酸(Lys，16)、絲氨酸(Ser，17)、天冬酰胺(Asn，18)、瓜氨酸(Cit，19)、天冬氨酸(Asp，20)、組氨酸(Hit，21)、精氨酸(Arg，22)、谷氨酰胺(Gln，23)、鳥氨酸(Orni，24)，核苷類對照品：胸腺嘧啶(25)、胸苷(26)、2′-脫氧尿苷(27)、2′-脫氧腺苷(28)、腺嘌呤(29)、次黃嘌呤(30)、尿苷(31)、腺苷(32)、2′-脫氧肌苷(33)、肌苷(34)、胞嘧啶(35)、胞苷(36)、黃嘌呤(37)、鳥苷(38)、腺苷-3′，5′-環(huán)單磷酸(39)、3′，5′-環(huán)磷酸鳥苷鈉鹽(40)、2′-脫氧腺苷-5′-單磷酸(41)均購自Sigma公司。以上對照品純度經(jīng)HPLC檢測器含量均大于98%。

空心蓮子草樣品于2016年6月采集，所采集樣品經(jīng)安慶醫(yī)藥高等?？茖W校談永進教授鑒定為莧科植物空心蓮子草AlternantheraPhiloxeroides(Mart.) Griseb的地上部分，以枝剪分離莖、葉、花三個不同部位，分別于45 ℃低溫烘干，粉碎，存放于安慶醫(yī)藥高等?？茖W校標本館。

Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)(四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機和自動進樣器)、Xevo TQ檢測器和MassLynxTM質(zhì)譜工作站軟件(Waters公司)，分析天平(1/1萬，瑞士Mettler Toledo公司)，超純水系統(tǒng)(南京易普達易科技發(fā)展有限公司)；超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Microfuge? 22R Centrifuge離心機(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 氨基酸及核苷類成分分析方法

1.2.1 供試品溶液制備 精密稱定樣品粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取超純水25 mL，稱重，靜置30 min，以100 Hz，50 ℃超聲60 min，冷卻后以超純水補足減失重量，搖勻，離心(13 000 r/min)10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得[17-18]。

1.2.2 對照品溶液制備 取干燥至恒重的各對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加少量10%甲醇，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，配成氨基酸與核苷類成分混合對照品儲備液[19]，所含待測物濃度分別為：1，61.75 μg/m；2，30.50 μg/m；3，36.25 μg/m；4，41.75 μg/m；5，43.75 μg/m；6，35.00 μg/m；7，117.8 μg/m；8，37.50 μg/m；9，87.00 μg/m；10，37.75 μg/m；11，116.0 μg/m；12，49.00 μg/m；13，36.75 μg/m；14，56.75 μg/m；15，67.25 μg/m；16，63.50 μg/m；17，67.25 μg/m；18，77.75 μg/m；19，30.50 μg/m；20，131.3 μg/m；21，39.00 μg/m；22，42.75 μg/m；23，67.00 μg/m；24，10.25 μg/m；25，26.3 μg/m；26，17.4 μg/m；27，16.9 μg/m；28，30.6 μg/m；29，13.1 μg/m；30，28.8 μg/m；31，15.9 μg/m；32，17.6 μg/m；33，14.5 μg/m；34，28.5 μg/m；35，20.1 μg/m；36，16.2 μg/m；37，18.7 μg/m；38，17.9 μg/m；39，13.2 μg/m；40，40.9 μg/m；41，14.3 μg/m。

1.2.3 色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱[19]：Acquity UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A-含5 mmol/L甲酸銨、乙酸銨和0.2%甲酸的水溶液，B-含1 mmol/L甲酸銨、乙酸銨和0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫(0～3 min，10% A；3～9 min，10→18% A；9～15 min，18→20% A，15～16 min，20→46% A，16～18 min，46% A)；流速：0.4 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣體積：1 μL。

質(zhì)譜檢測方式[17]：多反應檢測(MRM)；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：0.15 mL/min；取樣錐孔電壓：4 V；碰撞能量：18 eV。各對照品質(zhì)譜條件見表1、表2，色譜離子流見圖1。

表1 24種氨基酸成分的主要質(zhì)譜檢測參數(shù)

續(xù)表1 24種氨基酸成分的主要質(zhì)譜檢測參數(shù)

注：a用于定量的離子對。

表2 17種核苷成分的主要質(zhì)譜檢測參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的建立及方法學考察

本研究參考棗屬植物中核苷、氨基酸類成分的定性定量分析方法[19-21]，為縮短分析時間、減少樣品制備次數(shù)，參考文獻[19，22，23]建立了同時測定17種核苷類成分、24種氨基酸類成分的UPLC-MS/MS分析方法。分別測定其線性關(guān)系、精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率等，以驗證本研究所建立的分析方法適用性、可靠性。

2.1.1 線性關(guān)系考察 參照“1.2.2”項方法制備混合對照品，逐級稀釋，進樣分析，考察線性關(guān)系。各待測成分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)測定結(jié)果見表2，結(jié)果表明各成分在相應的線性范圍內(nèi)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.990 4～1.000。

2.1.2 精密度、重復性及穩(wěn)定性試驗 取混合對照品溶液，按“1.2.3”項下方法重復進樣6針，以峰面積計算的RSD值作為精密度試驗結(jié)果；取樣品KH，按“1.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.3”項下方法測定待檢化合物質(zhì)量分數(shù)，計算RSD值，得重復性試驗結(jié)果；隨機取重復性試驗中供試品溶液1份，室溫條件下于0、2、4、8、12、16、24 h分別取樣進行測定，以峰面積計算的RSD值作為穩(wěn)定性試驗結(jié)果，見表2，由表2可知，精密度試驗RSD值在1.64%～5.68%，重復性試驗RSD值在1.33%～5.97%，穩(wěn)定性試驗RSD值在0.97%～5.96%。表明本研究所用分析方法精密度、重復性好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

A.氨基酸；B.核苷

續(xù)表3 核苷、氨基酸類成分測定方法學考察結(jié)果

2.1.3 加樣回收率試驗 準確稱取KH樣品6份，各0.25 g，分別適量加入質(zhì)量濃度已知的對照品溶液。按“1.2.1”方法分別制備供試品溶液，按“1.2.3”項下方法測定待檢化合物質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表2，顯示其回收率為93.1%～103.9%，RSD<5.5%，表明本研究方法準確可靠。

2.2 空心蓮子草中氨基酸、核苷類成分含量測定

基于以上方法學研究，選定最佳參數(shù)，采用外標一點法計算各樣品溶液中待檢化合物的濃度，并計算最終樣品(以干重計)中各成分的含量，結(jié)果見表3。比較空心蓮子草不同部位干燥品中各待檢化合物的含量，結(jié)果表明：空心蓮子草所有樣品中都含有豐富的含核苷類、氨基酸類成分，氨基酸類成分含量較核苷類成分含量更多，其總量最高可達9.464 0 mg/g，核苷類成分含量達2.576 0 mg/g。在核苷類成分中，含量較豐富的依次為腺苷、尿苷、次黃嘌呤和肌苷。脯氨酸含量為游離氨基酸中最高，達1.007 mg/g，其次為異亮氨酸(0.971 6 mg/g)、丙氨酸(0.903 5 mg/g)、谷氨酸(0.885 4 mg/g)。其中，γ-氨基丁酸是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動，研究表明γ-氨基丁酸可健腦益智、促進睡眠、延緩腦衰老機能、降血壓等[19]?？招纳徸硬輼悠分芯?種必需氨基酸，表明其可用于營養(yǎng)保健產(chǎn)品的開發(fā)。

表4 空心蓮子草不同器官核苷類、氨基酸類成分分析結(jié)果

注：nda未檢測到；trb低于定量限。

3 討論

本研究采用UPLC-TQ MS法建立了空心蓮子草中17種核苷類和24種游離氨基酸類的分析方法，研究結(jié)果表明，所有空心蓮子草樣品均含有豐富的氨基酸類、核苷類成分，其中在核苷類成分中，以腺苷、尿苷、次黃嘌呤和肌苷含量相對較高；在游離氨基酸中以脯氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量相對較高，表明空心蓮子草具有較高的營養(yǎng)保健開發(fā)價值。本研究揭示了游離氨基酸類和核苷類成分在空心蓮子草中的含量，可為空心蓮子草的營養(yǎng)保健開發(fā)選擇提供數(shù)據(jù)支撐，為其資源合理綜合利用及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學依據(jù)。