于光輝，姜建陽(yáng)，張華杰，耿 梅，宋春陽(yáng)

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東 青島266109；2.威海市動(dòng)物疾病控制預(yù)防中心,山東 威海264200)

斷奶仔豬由于消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等生理機(jī)能發(fā)育不夠完善,消化酶及胃酸分泌不足,腸道內(nèi)微生物區(qū)系尚未建立,體溫調(diào)節(jié)能力差[1],導(dǎo)致仔豬在斷奶時(shí)會(huì)表現(xiàn)出一系列的癥狀,如食欲減退、消化力差、腹瀉、抵抗力差、易被病原微生物侵襲等,從而造成消化不良、體弱、生長(zhǎng)發(fā)育受阻、飼料報(bào)酬低等斷奶應(yīng)激綜合征[2]。斷奶應(yīng)激是豬生產(chǎn)中的一個(gè)普遍現(xiàn)象,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

寄居在動(dòng)物腸道中的細(xì)菌對(duì)于維持寄主的健康發(fā)揮著重要的作用,腸道微生物菌落能夠幫助寄主消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、提高免疫力、維持上皮細(xì)胞發(fā)育,并且是抵御外源致病菌的天然屏障[3]。當(dāng)然,腸道微生物也有不利的方面,它能通過與遺傳距離較遠(yuǎn)的致病菌以等位基因交換的方式,或者整合幾種致病菌的致病基因變?yōu)樾碌闹虏【鶾4-5]。斷奶應(yīng)激和日糧改變會(huì)打破微生態(tài)的平衡,導(dǎo)致乳酸菌減少,大腸桿菌增多,而多數(shù)人認(rèn)為仔豬斷奶后腹瀉的主要致病菌就是大腸桿菌[6]。乳酸桿菌與腸桿菌的比例通常被用于評(píng)價(jià)腸道的健康水平,比值增加說明腸道健康,斷奶導(dǎo)致比值下降,仔豬腸道健康受到威脅引發(fā)腹瀉甚至死亡,仔豬斷奶后抑制腸道菌能夠預(yù)防或者降低腹瀉的程度[7]。

眾所周知,中國(guó)地方品種豬經(jīng)過幾千年的遺傳進(jìn)化,有著豐富的遺傳多樣性,有很多優(yōu)良性狀是引進(jìn)品種豬所不具備的,它們更能適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境,并且比國(guó)外品種有獨(dú)特的抗逆性,腸道微生物菌群相對(duì)穩(wěn)定,斷奶應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)較小。本研究以萊蕪豬和杜-長(zhǎng)-大仔豬為研究對(duì)象,比較兩品種仔豬斷奶前后腸道微生物的變化情況,為豬的抗逆性狀選育和微生態(tài)制劑的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)選擇同一日齡出生的健康杜-長(zhǎng)-大仔豬和萊蕪豬各10 頭(來自同一窩)作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 兩品種仔豬均于28 日齡斷奶,每個(gè)品種為1 個(gè)處理組,根據(jù)斷奶時(shí)間分為5 個(gè)階段,分別是斷奶前1 周(21 d)、斷奶當(dāng)天(28 d)、斷奶后1 d(29 d)、斷奶后1 周(35 d)及斷奶后2 周(42 d),每個(gè)處理組每個(gè)階段隨機(jī)選取2 頭仔豬屠宰取樣。

1.3 試驗(yàn)日糧 仔豬出生5 d 開始補(bǔ)飼通威-200乳豬教槽料,所有試驗(yàn)豬在相同的環(huán)境下采用相同的飼喂方式。

1.4 飼養(yǎng)管理 豬的飼養(yǎng)試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)即墨段泊嵐學(xué)生教學(xué)實(shí)習(xí)基地進(jìn)行,仔豬出生第2 天補(bǔ)鐵,第5 天開始補(bǔ)飼,第28 天時(shí)斷奶,仔豬斷奶后轉(zhuǎn)入保育舍仍飼喂1 周的教槽料,以后逐漸過渡飼喂保育料,每天更換20%,整個(gè)試驗(yàn)期仔豬自由采食和飲水。

1.5 樣品采集 每個(gè)階段試驗(yàn)結(jié)束時(shí),兩個(gè)品種各選取2 頭體重相近的仔豬,當(dāng)日清晨9:00 將其頸靜脈放血致死,打開腹腔立即結(jié)扎幽門瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止消化道樣品的相互污染。迅速找到空腸后端,取出50 g 左右的食糜,立即放入液氮速凍,然后移入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 腸道微生物DNA 提取 采集腸道內(nèi)容物(200 mg 左右)保存在3 mL 無(wú)水乙醇中,提取DNA前用13 000 r/min 離心5 min,腸道微生物DNA 從離心沉淀中提取,用商業(yè)化生產(chǎn)的QIAamp DNA Stool Mini Kit(Cat.51504,德國(guó))試劑盒,所有步驟均按照說明書進(jìn)行操作。每個(gè)階段同一品種的兩頭仔豬取等量的DNA 進(jìn)行混合,為后續(xù)試驗(yàn)提供材料。

1.6.2 16S rDNA V3 區(qū)PCR 擴(kuò)增 采用Touchdown PCR 對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增引物如下:341 fGC:(5′-GCC GCC CGC CGC GCG CGG CGG GCG GGG CGG GGG CAC GGG GGG CCT ACG GAG GCA GCA G-3′),518 r:(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)其中GC 夾子為CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G,擴(kuò)增體系為50 μL,陽(yáng)性對(duì)照用ddH2O 做模板。Touchdown PCR 擴(kuò)增條件:95 ℃5 min,94 ℃30 s,58 ℃30 s(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃),72 ℃30 s,10 個(gè)循環(huán)的降落PCR 擴(kuò)增完成后取5 μL 擴(kuò)增引物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.3 DGGE 凝膠電泳 DGGE 用采用6%聚丙烯酰胺凝膠,分離細(xì)菌16S rDNA 的V3 可變區(qū)片段,濃度梯度為38%～50%。DGGE 電泳程序?yàn)?首先在200 V 電壓條件下,電泳10 min,隨后在85 V 固定電壓、60 ℃的0.5x TAB 緩沖液(20 mmol/L Tris、10 mmol/L乙酸和0.5 mmol/L EDTA,pH 值7.5)中電泳16 h。電泳結(jié)束后,采用AgNO3染法進(jìn)行染色。曝光照相后,對(duì)一些亮的條帶進(jìn)行切膠回收DNA 片段,克隆測(cè)序后在NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行BLAST 比對(duì),鑒定細(xì)菌的類型。

1.6.4 熒光定量PCR 檢測(cè)菌群表達(dá)量 空腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌的菌群數(shù)量用Q-PCR(SYBR Premix Ex TaqTM,TaKaRa 公司,寶生物工程(大連)有限公司)檢測(cè),引物參照Han,et al.(2013)的進(jìn)行,詳見表1。各細(xì)菌的反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃15 s,60 ℃1 min,72 ℃45 s,87 ℃5 s 共40個(gè)循環(huán),以72 ℃10 min 延伸后結(jié)束。擴(kuò)增和檢測(cè)DNA 的熒光定量PCR 用ABI 7900 儀器,反應(yīng)體系包括上下游引物各0.75 μL,Plus 12.5 μL,Tap 酶2 μL,Dye 0.5 μL,H2O 8.5 μL。

表1 熒光定量PCR 檢測(cè)3 種細(xì)菌的引物信息

1.7 統(tǒng)計(jì)與分析 兩品種豬在不同階段的數(shù)據(jù)分析用SAS 9.4 軟件GLM 過程進(jìn)行方差分析(SAS Inst.Inc.,Cary,NC),菌群的Q-PCR 每個(gè)樣本8 個(gè)重復(fù),選擇5 個(gè)平行較好的數(shù)值進(jìn)行-△△t 統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)表示為平均值。PCR-DGGE 指紋圖譜用Quantity One(BIO-RAD,CA)和Biodap 軟件計(jì)算菌群的豐度、Shannon-Wiener 指數(shù)和均勻度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DGGE 檢測(cè)腸道微生物 兩品種仔豬斷奶前后不同階段腸道微生物DGGE 檢測(cè)結(jié)果見圖4,斷奶前1 周兩品種豬的微生物菌群豐度差異不明顯(a和b 泳道),但是斷奶后1 d 比斷奶前1 周微生物復(fù)雜(c 和d 泳道),并且萊蕪豬比杜-長(zhǎng)-大仔豬更復(fù)雜些。菌群的復(fù)雜程度在斷奶后1 周逐漸降低(e和f 泳道),并且萊蕪豬的仍然比杜-長(zhǎng)-大的要復(fù)雜。優(yōu)勢(shì)菌群的菌落在斷奶后1 周比斷奶前1 周和斷奶后1 d 都有所改變。兩品種仔豬菌群在斷奶后2 周都下降(g 和h 泳道),并且優(yōu)勢(shì)菌群也不盡相同。

圖1 DGGE 測(cè)定兩品種仔豬斷奶前后空腸微生物菌群

2.2 腸道微生物菌群分析 空腸腸道微生物香農(nóng)-維納指數(shù)和豐度信息見表2,總體來看兩品種之間微生物菌群多樣性的差別是比較明顯的,在各個(gè)階段萊蕪豬比杜-長(zhǎng)-大仔豬有更多的菌群數(shù),菌群多樣性在斷奶后1 d 還是比較豐富的,斷奶后的前2周菌群相對(duì)較少,以后逐漸趨于平衡。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群切膠測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌在各個(gè)時(shí)期都比較豐富(圖1,箭頭5),產(chǎn)腸毒素大腸桿菌僅在斷奶后出現(xiàn),斷奶后1 d 迅速增殖,并且成為腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群(圖1,箭頭7)。乳酸桿菌作為動(dòng)物健康的有益菌,在仔豬腸道中并不是優(yōu)勢(shì)菌群,DGGE 只能在兩品種仔豬斷奶前和萊蕪豬斷奶后1 d 檢測(cè)到(圖1,箭頭1),腸桿菌和腸球菌在各個(gè)時(shí)期都是腸道優(yōu)勢(shì)菌群(圖1,箭頭4 和10)。

表2 空腸菌群的豐度、香農(nóng)-維納指數(shù)和均勻度信息

2.3 熒光定量PCR 檢測(cè)腸道菌群 雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌是動(dòng)物腸道中常見的幾種優(yōu)勢(shì)菌群,Q-PCR 檢測(cè)這3 種菌群的相對(duì)含量(圖2)。

由圖2 可見,萊蕪豬的雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌在斷奶前后各個(gè)時(shí)期變化是逐漸過渡,比較平緩,但是在杜-長(zhǎng)-大仔豬腸道中變化幅度比較大。兩品種仔豬在斷奶前1 周、斷奶后1 d 和斷奶后2周的雙歧桿菌差異不顯著(P ＞0.05),但是在斷奶后1 周萊蕪豬是杜-長(zhǎng)-大仔豬的6.4 倍(P ＜0.01)。對(duì)于乳酸桿菌在斷奶前1 周和斷奶后1 周杜-長(zhǎng)-大仔豬是萊蕪豬2 倍左右(P ＜0.01),但是在其他時(shí)期兩品種仔豬之間差異不顯著(P ＞0.05)。萊蕪豬比杜-長(zhǎng)-大仔豬的大腸桿菌在各個(gè)時(shí)期都相對(duì)較低,杜-長(zhǎng)-大仔豬斷奶后1 周空腸大腸桿菌比萊蕪豬高87%(P ＜0.05)。

3 討論

腸道微生態(tài)平衡對(duì)動(dòng)物的健康至關(guān)重要,在養(yǎng)豬生產(chǎn)中,斷奶必然改變腸道微生物菌群平衡,仔豬斷奶應(yīng)激會(huì)打破微生態(tài)平衡,導(dǎo)致乳酸菌等有益菌減少,而大腸桿菌增加,引發(fā)大腸桿菌性腹瀉。熒光定量PCR 是檢測(cè)腸道菌群相對(duì)含量的有效方法[8-9],本試驗(yàn)定量檢測(cè)了雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌在不同斷奶期的相對(duì)含量,在不同的斷奶期會(huì)有相應(yīng)的變化,與其他人的研究結(jié)果相似[10-11]。用DGGE 的方法只能在兩品種仔豬的斷奶前1 周和萊蕪豬斷奶后1 d 檢測(cè)到乳酸菌,但是通過特異引物熒光定量PCR 卻可以在其他時(shí)期檢測(cè)到。另外,令人疑惑的是乳酸菌在杜-長(zhǎng)-大仔豬斷奶后1 周是優(yōu)勢(shì)菌群,但是在斷奶后2 周急劇下降。

圖2 兩品種仔豬斷奶前后雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸桿菌相對(duì)含量

大腸桿菌不僅影響豬的腸道生理狀態(tài),而且影響其免疫應(yīng)答。有些飼料添加劑通過干擾腸道微生物種群來緩解仔豬斷奶應(yīng)激,例如低聚甘露糖,它是一種從酵母菌中提取的細(xì)胞壁成分,它能夠干擾細(xì)菌與上皮細(xì)胞的結(jié)合,調(diào)節(jié)腸道微生物系統(tǒng),降低腸道致病菌繁殖[8],提高動(dòng)物的免疫力。氧化鋅可以通過降低大腸桿菌種系的多樣性來增加腸道微生物菌群的穩(wěn)定性[6]。

pH 值是動(dòng)物體內(nèi)消化環(huán)境的重要因素,適宜的酸堿環(huán)境是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分消化吸收、有益菌群合理生長(zhǎng)、病原微生物受到有效抑制的必要條件[12]。仔豬出生后,胃內(nèi)pH 值隨著體重的增加而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；仔豬斷奶后,消化道內(nèi)的pH 值會(huì)顯著升高,高于斷奶前的pH 值[13]。消化道pH 值升高,不僅會(huì)對(duì)腸道消化酶活性產(chǎn)生影響,還會(huì)導(dǎo)致腸道菌群紊亂,病原菌大量增殖,特別是大腸桿菌,引起仔豬腹瀉[10]。由于斷奶后胃和十二指腸pH 值明顯升高,使胃蛋白酶活性降低,對(duì)飼料的消化吸收能力減弱,引發(fā)食欲不振、腹瀉等問題[14]。另外,酸堿度會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),酸度增加可促進(jìn)細(xì)胞分裂,加快腸黏膜的修復(fù)[15](Godlewski,et al.2009)。

4 結(jié)論

萊蕪豬比杜-長(zhǎng)-大仔豬斷奶后腸道微生物更加豐富,并且萊蕪豬的腸道微生物在斷奶后能夠很快建立起新的平衡,萊蕪豬比杜-長(zhǎng)-大仔豬有更強(qiáng)的抗斷奶應(yīng)激能力。