梁 武，喬 健，李亞杰，易小萍，楊保收

(1.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀100193；2.天津瑞普生物技術股份有限公司,天津 空港300308；3.華東理工大學生物反應器國家重點實驗室,上海 徐匯200237)

豬圓環(huán)病毒病(PCVD)主要由豬2 型圓環(huán)病毒(PCV2)引起的免疫抑制性疾病,造成免疫抑制,使豬群生產(chǎn)性能下降,自1991 年發(fā)現(xiàn)以來已成為危害養(yǎng)豬的主要疫病之一,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。疫苗免疫是預防PCVD 最有效的手段,目前國內外學者對PCV2 疫苗的研究主要是從滅活疫苗、嵌合病毒疫苗、亞單位疫苗、重組腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面進行研究。在我國,已商品化的PCV2 疫苗絕大部分為全病毒滅活疫苗,但PCV2 增殖滴度較低,PCV2 感染宿主細胞后,病毒采用滾環(huán)復制(Rolling circle replication)模式進行復制,在病毒生長的S 期復制效率較高,隨宿主細胞復制而復制,因此,PCV2 的復制周期比其他病毒長,這為研究高效PCV2 疫苗帶來了障礙[4-5]。為了提升PCV2 疫苗市場競爭力,就需要優(yōu)化疫苗生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,減少批間差異,保證產(chǎn)品質量穩(wěn)定。本研究利用細胞微載體懸浮培養(yǎng)技術摸索PCV2 在敏感細胞株PK-15 細胞增殖工藝,旨在打破現(xiàn)有PCV2 滅活疫苗生產(chǎn)過程中病毒效價低的技術瓶頸,從而進一步提升PCV2 疫苗質量和臨床免疫效果,帶動行業(yè)技術升級。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株、細胞與血清 豬圓環(huán)病毒PCV2-ZJ/C 株,病毒含量107.5TCID50/mL,由天津瑞普生物技術股份有限公司制備、保存；PK-15 細胞由本公司研究院保存,新生牛血清,購自美國Gibco 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及生物反應器 PK-15 細胞專用低血清培養(yǎng)基P-LSM,購自蘇州沃美生物技術有限公司(貨號P22301-2)；14 L、42 L 生物反應器,購自德國賽多利斯(Sartorius)公司。

1.1.3 單抗及微載體 PCV2 免疫熒光單抗由浙江大學周繼勇教授惠贈；Cytodex1 微載體,購自GE Healthcare 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞密度的測定 采用結晶紫染色法,計算微載體上細胞數(shù)量,具體步驟為:將樣品吹打均勻后取出1 mL 微載體懸液置于EP 管中,1 000 r/min,離心5 min 后棄上清,加入等量的0.1%檸檬酸結晶紫(0.1 mol/L)溶液并混勻,37 ℃孵育1 ～2 h 后,用移液槍吹打,使微載體上的細胞脫落并保證細胞核全部釋放,稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放的細胞核,即為細胞的密度。

1.2.2 病毒滴度的測定 參照農業(yè)部第1893 號公告,按照“豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(ZJ/C 株)制造及檢驗試行規(guī)程”進行PCV2 ZJ/C 株毒液病毒滴度的測定(間接免疫熒光法)。

1.2.3 細胞初始接種密度優(yōu)化 設定0.25×106、0.5×106、0.75×106、1.00×106cells/mL 四個初始細胞接種密度,分別接種于14 L 生物反應器培養(yǎng),每隔24 h 取樣進行細胞計數(shù),繪制細胞生長曲線。其他參數(shù)條件為:微載體濃度:3 g/L,攪拌轉速:60 r/min,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,培養(yǎng)溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用低血清培養(yǎng)基。

1.2.4 微載體濃度的優(yōu)化 選取濃度分別為2、3、4、5 g/L 的微載體與適量細胞濃度(0.5×106cells/mL)懸液于14 L 反應器進行培養(yǎng),觀察不同微載體濃度對細胞生長影響,確定微載體最適濃度。其他參數(shù)條件:細胞初始接種密度:0.5×106cells/mL,攪拌轉速:60 r/min,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用培養(yǎng)基。

1.2.5 攪拌轉速選擇 設定50、60、70、80 r/min 4個攪拌轉速,于14 L 反應器培養(yǎng),每隔24 h 取樣觀察計數(shù)、繪制細胞生長曲線,選擇最適攪拌轉速。其他參數(shù)條件:細胞初始接種密度:0.5×106cells/mL,微載體濃度:3 g/L,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用培養(yǎng)基。

1.2.6 不同接毒時間對ZJ/C 株增殖的影響 將PK-15 細胞以0.5×106cells/mL 的密度接種于14 L反應器,分別在細胞生長0、6、12 h 和24 h,以病毒感染復數(shù)(MOI)0.5 接種PCV2-ZJ/C 株,于培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 分別取樣,測定病毒滴度,確定最適接毒時間。其他參數(shù)條件:溶氧(DO)40%,轉速:60 r/min,溫度:37 ℃。

1.2.7 接毒劑量對ZJ/C 株增殖的影響 將PK-15細胞以0.5×106cells/mL 密度接于14 L 反應器,細胞培養(yǎng)6 h 時,分別設定MOI 為0.05、0.5、1、3 四組,于病毒培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度,確定最適接毒劑量。其他參數(shù)條件:轉速:60 r/min,溫度:37 ℃。

1.2.8 收毒時間的確定 將PK-15 細胞以0.5×106cells/mL 密度接種于14 L 反應器中,細胞培養(yǎng)6 h 接毒(MOI 為0.5),于病毒培養(yǎng)第60、72、96 h和120 h 分別取樣,測定病毒滴度,確定最適收毒時間。其他參數(shù)條件:病毒感染復數(shù):0.5,轉速:60 r/min,培養(yǎng)溫度:37 ℃。

1.2.9 培養(yǎng)溫度對PCV2 增殖的影響 將PK-15細胞以0.5×106cells/mL 密度接種于14 L 反應器中,培養(yǎng)6 h 后接毒,分別設定36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃培養(yǎng),于病毒培養(yǎng)60、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度,確定最適培養(yǎng)溫度。其他培養(yǎng)條件:病毒感染復數(shù):0.5,轉速:60 r/min。

1.2.10 PK-15 細胞懸浮培養(yǎng)消化與放大工藝驗證 按照預準備、細胞消化、重懸培養(yǎng)三步進行放大工藝研究,方法如下:(1)預準備:細胞消化前,先將適量培養(yǎng)基與微載體處理液注入42 L 反應器；(2)清洗:將14 L 反應器細胞打入消化罐,間斷性攪拌棄去生長液,注入PBS,清洗微載體；(3)消化:將適量胰酶注入消化罐中,采用間歇性攪拌棄去胰酶方式消化載體上細胞；(4)終止:將生長液注入消化罐中,攪拌終止消化并注入42 L罐。補足培養(yǎng)液。參數(shù)如下:轉速:35 r/min,病毒培養(yǎng)溫度:39 ℃,MOI:0.5,病毒培養(yǎng)96 h 收獲,測定病毒滴度。

2 結果與分析

2.1 細胞初始接種密度優(yōu)化 選擇0.25×106、0.5×106、0.75×106、1.00×106cells/mL 四個接種密度分別于14 L 反應器培養(yǎng),結果表明,密度為0.5×106cells/mL 和0.75×106cells/mL 時,細胞生長延滯期均較短,均可達到最大細胞密度,基于生產(chǎn)成本考慮,選擇0.5×106cells/mL 為細胞的最佳初始接種密度(見圖1)。

圖1 不同初始接種密度PK-15 細胞生長曲線

2.2 微載體濃度優(yōu)化 選取2、3、4、5 g/L 的微載體濃度與0.5×106cells/mL 細胞懸液在14 L 反應器培養(yǎng),結果表明,當微載體濃度為3 g/L 時,細胞于微載體上生長滿球率最高,達到95%以上(見圖2、圖3),初步確定3 g/L 為最佳微載體使用濃度。

圖2 PK-15 細胞在3 g/L 微載體濃度下狀態(tài) (20×)

圖3 不同微載體濃度培養(yǎng)PK-15 細胞比較

2.3 攪拌轉速的選擇 選取不同攪拌轉速于14 L反應器進行PK-15 細胞培養(yǎng),結果表明,當攪拌轉速為60 r/min 時,細胞生長密度最大,因此,選擇60 r/min 為最適攪拌轉速(見圖4)。

圖4 不同攪拌轉速下PK-15 細胞生長密度的比較

2.4 病毒接種時間的確定 選取細胞生長0、6、12 h 和24 h 四個接毒時間于14 L 反應器進行病毒培養(yǎng),于細胞培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結果表明,當細胞生長6 h 時接毒,產(chǎn)毒效果最好,培養(yǎng)96 h 收獲病毒滴度可達108.0TCID50/mL,因此,確定細胞培養(yǎng)6 h 為最佳接毒時間(見圖5)。

圖5 不同接毒時間的PCV2 增殖曲線

2.5 病毒感染復數(shù)(MOI)的確定 選取接毒劑量(MOI)為0.05、0.5、1、3 于14 L 反應器進行病毒培養(yǎng),病毒培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結果表明,病毒感染復數(shù)MOI 為0.5、1 時,產(chǎn)毒效果最好,病毒最高滴度107.8TCID50/mL,因此,考慮成本因素,選擇MOI 為0.5 為最佳接毒劑量(見圖6)。

圖6 不同接毒劑量的PCV2 增殖曲線

2.6 最佳收毒時間的確定 選取病毒培養(yǎng)60、72、96 h 和120 h 四個不同收毒時間于14 L 反應器進行病毒培養(yǎng)。結果表明,96 h 收獲病毒滴度最高,達到108.5TCID50/mL,因此,選擇96 h 為最佳收毒時間(見圖7)。

圖7 最佳收毒時間的確定

2.7 病毒培養(yǎng)溫度的確定 選擇36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃4 個溫度于14 L 反應器進行病毒培養(yǎng),病毒培養(yǎng)60、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結果表明,39 ℃時細胞生長較快,產(chǎn)毒較37 ℃培養(yǎng)要高,最高滴度108.5TCID50/mL,較37 ℃培養(yǎng)高0.5 個滴度。因此,選擇39 ℃為最佳病毒增殖溫度(見表1)。

表1 不同培養(yǎng)溫度下PCV2 增殖滴度

2.8 微載體懸浮培養(yǎng)PK-15 細胞14 L 罐消化分散結果 按1.2.10 項方法,將14 L 反應器微載體懸浮培養(yǎng)48 h 的PK-15 細胞進行消化分散。結果表明,95%以上的PK-15 細胞從微載體上成功消化,細胞分散良好,折光性好,無明顯結團現(xiàn)象,可滿足下一級42 L 罐進行PCV2 病毒培養(yǎng)(見圖8)。

圖8 14 L 反應器培養(yǎng)PK-15 細胞消化分散效果

2.9 PCV2 ZJ/C 株的生物反應器42 L 放大培養(yǎng)工藝驗證及與轉瓶培養(yǎng)工藝的比較 按方法1.2.10項確定的工藝參數(shù),于42 L 反應器中培養(yǎng)48、72、96 h 后收獲病毒,結果表明,按上述14 L 已摸索接毒工藝,病毒培養(yǎng)96 h 收獲,病毒滴度可穩(wěn)定在108.3TCID50/mL,是轉瓶培養(yǎng)工藝的10 倍(見表2)。因此,本研究初步建立了一種高效、穩(wěn)定、低成本利用PK-15 細胞反應器微載體懸浮培養(yǎng)PCV2 抗原的生產(chǎn)工藝。

表2 42 L 生物反應器培養(yǎng)PCV2 ZJ/C 株毒價驗證

3 討論

應用微載體培養(yǎng)技術,初期細胞快速貼附并延展是培養(yǎng)成功的關鍵之一,因此,多數(shù)學者趨向于提高細胞初始接種密度和采用間歇攪拌方式。但也有人提出間歇攪拌會使細胞在微載體上貼附不均一,出現(xiàn)空微載體的幾率大大增加[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),當初始接種密度為0.5×106cells/mL 和0.75×106cells/mL時,細胞生長延滯期均較短,細胞密度最大,并沒有因初始接種密度的無限增大而增加細胞密度,進一步說明高接種密度時,細胞會更早進入對數(shù)生長期,細胞受到接觸抑制作用的程度比低接種密度組更強,使得細胞比生長速率下降更快；而采用低轉速連續(xù)攪拌效果較好,可使細胞在微載體上均勻分布,對細胞生長影響最小,微載體滿球率更高。

微載體消化放大工藝是指用胰蛋白酶消化上一級反應器中貼附于微載體上的細胞,并把細胞或細胞和舊微載體接入下一級更大規(guī)模反應器,補加新微載體和新鮮培養(yǎng)基進行新一輪的培養(yǎng)。本研究采用將消化下來的細胞和舊微載體一起接入下一級反應器的方法,解決了新舊微載體上細胞貼附不均勻的問題,從而提高了消化放大過程中的細胞回收率,減少了新微載體的消耗。消化放大工藝中存在的種種難題是微載體廣泛應用于大規(guī)模生產(chǎn)的障礙,除了細胞培養(yǎng)、消化等設備的限制,微載體上連續(xù)消化傳代過程中細胞生長速率的急劇下降是普遍面臨的難題。Forestell 等認為培養(yǎng)基中的血清濃度是關鍵因素,他們證明降低培養(yǎng)基中血清含量可有效緩解MRC-5 細胞在微載體傳代過程中生長速率的下降[8-9]。

本研究通過對PK-15 細胞懸浮馴化及生物反應器培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化研究,進一步說明應用生物反應器系統(tǒng)和微載體懸浮培養(yǎng)技術培養(yǎng)PK-15 細胞,在細胞密度、比生長速率等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)轉瓶培養(yǎng)方式；在此基礎上,通過優(yōu)化PCV2 在生物反應器培養(yǎng)工藝參數(shù),進行了14 L 至42 L 生物反應器消化放大并獲得成功,其病毒滴度較轉瓶相比提高了約10 倍,為下一步實現(xiàn)1 000 升級工業(yè)規(guī)模放大工藝奠定了基礎。