韓姝伊，魏 凱，陳春山，何亞鵬，趙寶華，何宏軒

(1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 石家莊050024；2.中國科學(xué)院動物研究所,北京 朝陽100101；3.北京市水生野生動植物救護中心,北京 延慶102110)

細鱗鮭(Brachymystax Lenok)又名細鱗魚,屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)細鱗魚屬(Branchymystax),是我國名貴的冷水性經(jīng)濟魚類[1]。細鱗鮭在我國北方分布較為廣泛,主要有東北地區(qū)的黑龍江流域、圖門江等,華北地區(qū)的北京、河北北部白河上游、灤河上游,以及西北地區(qū)的新疆、陜西秦嶺等地[1]。在國外,還見于俄羅斯的西伯利亞、蒙古和朝鮮的河流之中。細鱗鮭已被列為國家Ⅱ級保護動物[2],為保護和合理開發(fā)細鱗鮭資源,已經(jīng)開展了細鱗鮭的人工繁育和養(yǎng)殖。近年來,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,養(yǎng)殖過程中病害頻發(fā)[3-4],造成的損失日益嚴重。

2017 年7 月,北京市水生野生動植物救護中心試驗養(yǎng)殖的細鱗鮭魚苗突發(fā)大規(guī)模死亡,癥狀表現(xiàn)為眼球凸出,鰓絲紅腫、充血,鰓蓋邊緣、鰭條基部充血,鰭條潰爛,部分病魚肛門紅腫。剖檢可見,腸道內(nèi)幾乎無食物,肝臟發(fā)白并伴有出血點。為了控制該疾病的蔓延,對從自然發(fā)病的細鱗鮭肝臟、腎臟、腸道處分離得到的優(yōu)勢菌株的理化特性、分子生物學(xué)特性以及耐藥性進行了分析,用生產(chǎn)上常用藥物進行了治療試驗,控制了病情發(fā)展。本試驗結(jié)果可為細鱗鮭細菌性疾病的診斷、防治和用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 患病細鱗鮭采集于北京市水生野生動植物救護中心,體長3.5 ～3.9 cm,體重為0.15 ～0.25 g 左右；健康細鱗鮭,體長5 ～8 cm,體重6 ～8 g。在實驗室飼養(yǎng)21 d 確定健康后用于回歸感染試驗。 養(yǎng)殖用水為曝氣的地下水,溫度10.2 ℃,pH 值=7.8,溶氧量＞10 mg/L。

1.2 細菌的分離純化 取發(fā)病癥狀明顯的細鱗鮭,在無菌條件下采集肝臟、腎臟、腸道,劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,25 ℃倒置培養(yǎng)24 h,肉眼觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、隆起度等。挑取形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落進行革蘭染色,并且進行下一步的分離傳代純化培養(yǎng),得到3 株優(yōu)勢菌株分別命名為BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。

1.3 回接感染試驗 使用1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104CFU/mL 濃度的BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3 菌液對健康細鱗鮭進行回歸感染試驗。各試驗組用健康細鱗鮭10 尾。采用腹腔注射方式進行攻毒,注射劑量為0.05 mL/尾,對照組注射等量的無菌生理鹽水,連續(xù)觀察14 d。分別于24 h、48 h 及72 h 后觀察記錄死亡情況及病理癥狀,同時用Reed-Muench 法計算菌株半數(shù)致死量(LD50)。

1.4 細菌的生理生化鑒定 將病原菌BJSY-1 在無菌條件下穿刺接種于細菌生化鑒定管中,進行葡萄糖、枸緣酸鹽等項目的生理生化特性測定,生化試驗結(jié)果參照微量生化反應(yīng)說明書及伯杰氏細菌鑒定手冊方法進行鑒定。

1.5 16S rDNA 序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細菌16S rDNA 通用引物對BJSY-1 株16S rDNA 基因進行擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,陽性樣品由北京六合華大科技有限公司進行測序。

將BJSY-1 菌株的16S rDNA 基因序列與Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中已知的氣單胞菌屬不同種的水產(chǎn)常見致病菌16S rDNA 核酸序列比較分析,根據(jù)比對結(jié)果檢索出同源性較高的序列采用Clustal W 進行多序列匹配分析,之后使用MEGA7.0 軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining,N J)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 藥敏實驗 藥敏實驗采用紙片擴散法進行。挑取純化后BJSY-1 單個菌落,接種于營養(yǎng)肉湯中,25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h 后使用比濁儀調(diào)節(jié)菌液濃度為0.5 個麥氏濁度,以無菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面,再用鑷子將藥敏紙片貼于MH 瓊脂平板表面。25 ℃培養(yǎng)24 h 后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm),并根據(jù)CLSI 標準進行藥敏結(jié)果判定。

1.7 病魚器官的肝臟組織切片 分別剖取健康細鱗鮭和患病細鱗鮭的肝臟組織,經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)取材,脫水,石蠟包埋,制片(4 μm厚),H.E.染色,光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.8 藥物治療試驗 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選取了四環(huán)素類的鹽酸多西環(huán)素、磺胺類的磺胺對甲氧嘧啶二甲氧芐啶、喹諾酮類的環(huán)丙沙星、頭孢類的頭孢曲松鈉以及酰胺醇類藥物氟苯尼考用于藥物治療試驗。試驗分為10 組,每組12 條魚,分別注射菌液濃度為1.0×106CFU/mL 的BJSY-1。在注射菌液1 d后使用5 種藥物通過浸浴和口服的方式進行治療,療程為21 d,口服時將藥物均勻地拌在飼料中制備成藥物餌料。每組所用藥物的用法、用量如表1所示。

表1 5 種藥物的用法及用量

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌形態(tài)特征 BJSY-1 為革蘭陰性菌,在普通營養(yǎng)瓊脂上形成圓形光滑、邊緣整齊、隆起、不透明、灰白色、中等大小的菌落。

2.2 回歸感染試驗 3 株分離菌均對細鱗鮭有不同程度的致病性,其中BJSY-1 的致病性最強,如表2 所示。人工感染BJSY-1 后的發(fā)病細鱗鮭均表現(xiàn)出鰭條基部及尾柄處充血、鰭潰爛,眼球凸出,肛門紅腫等癥狀,與自然感染的發(fā)病細鱗鮭一致。由此證明,BJSY-1 為此次細鱗鮭發(fā)病的主要致病菌,BJSY-2 和BJSY-3 為輔助致病菌。 利用Reed 和Muench 氏法計算BJSY-1 菌株的半數(shù)致死量LD50為6.97×105CFU/mL。

表2 分離菌株對細鱗鮭的致病性 (死亡率)

2.3 生理生化反應(yīng)結(jié)果 菌株BJSY-1 的生化鑒定結(jié)果見表3。其主要生理生化特征為氧化酶反應(yīng)陽性,不具有運動性,賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶陽性,不利用枸椽酸鹽,不形成吲哚,V-P 試驗陰性,能發(fā)酵葡萄糖,不能發(fā)酵蔗糖、棉子糖等。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》,將其初步判定為殺鮭氣單胞菌。

2.4 16S rDNA 基因序列和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析BJSY-1 菌株的PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,該菌株的16S rDNA 基因片段約1 500 bp(圖1),測序結(jié)果表明,該片段有1 420 bp。在NCBI 上進行同源性比對,結(jié)果顯示,BJSY-1 與氣單胞菌屬種類同源性最高。從NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中選取氣單胞菌屬中的其他致病菌:嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、中間氣單胞菌等以及不同亞種殺鮭氣單胞菌的16S rDNA 基因進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析,利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建進化樹。結(jié)果如圖2 所示,其與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(登錄號:KF:749360-1.1)聚為一分支。綜合生理生化鑒定結(jié)果及16S rDNA 基因序列分析結(jié)果,可以確認BJSY-1 為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)。

2.5 致病菌藥敏試驗 BJSY.1 菌株對27 種抗菌藥物的敏感性研究表明(表4),該菌株對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢呋辛、頭孢哌酮、四環(huán)素、氯霉素等高度敏感；對利福平、羅紅霉素、新霉素等中度敏感；磺胺甲唑、氨芐西林、萬古霉素、青霉素等對該菌株無抑制效果。

表3 BJSY-1 菌株的生理生化特性

圖1 菌株BJSY-1 的16S rDNA 的PCR 擴增結(jié)果

圖2 分離菌BJSY-1 16S rDNA 基因序列發(fā)育進化樹

表4 BJSY-1 菌株對27 種抗菌藥物的敏感性試驗

2.6 組織病理學(xué) 通過細鱗鮭肝臟組織切片染色,可以觀察到正常的肝細胞(HC)呈圓形且排列緊密,細胞界限清楚(見中插彩版圖3A)?；疾◆~肝結(jié)構(gòu)紊亂、細胞腫脹,有炎性細胞浸潤。出現(xiàn)廣泛的肝細胞脂肪變性,胞漿內(nèi)可見圓形小脂滴,如黑色箭頭所示；肝細胞核空泡化,如紅色箭頭所示(見中插彩版圖3B)。

2.7 藥物治療結(jié)果 使用藥物治療21 d 后,治療結(jié)果如表5 所示。與未進行治療的患病細鱗鮭死亡情況相比較,其中第6 組的治療效果最好?？诜侥峥嫉男Ч獌?yōu)于浸浴,浸浴與口服環(huán)丙沙星、磺胺對甲氧嘧啶二甲氧芐啶的效果相同,而鹽酸多西環(huán)素與頭孢曲松鈉則是浸浴效果優(yōu)于口服。

表5 治療結(jié)果

3 討論

3.1 殺鮭氣單胞菌的危害 殺鮭氣單胞菌是一種發(fā)生在鮭科魚類中的系統(tǒng)性疾病-癤瘡病的病原體。癤瘡病是一種普遍存在的疾病,它影響著世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖,可在野生和養(yǎng)殖、海水和淡水鮭魚的不同生長階段發(fā)病,其特點是發(fā)病率高,死亡率高[5]。近年來,發(fā)現(xiàn)殺鮭氣單胞菌的宿主范圍在擴大,除了鮭鱒魚類和鯉科等魚類外,在其他養(yǎng)殖品種上也發(fā)現(xiàn)了該病原。Fontes 等首次報道了從豬肉中分離到殺鮭氣單胞菌[6],林如濤等發(fā)現(xiàn)重慶地區(qū)的山羊感染殺鮭氣單胞菌[7]。國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的殺鮭氣單胞菌主要在冷水魚類上,丁雷等報道虹鱒感染殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種[8],劉艷輝等報道美洲紅點鮭潰爛病的病原為殺鮭氣單胞菌[9],細鱗魚感染殺鮭氣單胞菌在之前也有報道[10,15]?；疾〉孽q科魚類臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲減退,眼球突出,魚鰭基部出血,肛門紅腫。非鮭科魚類感染殺鮭氣單胞菌的癥狀主要為皮膚潰爛,形成膿腫。潰爛部位因魚的種類而異,如鯉科魚類感染殺鮭氣單胞菌后除頭部外身體其余部位均可發(fā)生潰爛,而牙鲆的潰爛主要發(fā)生在表皮[11]。殺鮭氣單胞菌是一種條件致病菌,在魚類受到環(huán)境脅迫時容易發(fā)病。本次疾病的暴發(fā)主要是此階段細鱗鮭魚苗正處在開口攝食人工飼料不久,體質(zhì)較弱,抵抗力差,從而引發(fā)了殺鮭氣單胞菌的感染。

3.2 殺鮭氣單胞菌的鑒定 殺鮭氣單胞菌根據(jù)理化特征分為5 個亞種,包括殺鮭亞種、無色亞種、殺日本鮭亞種、史氏亞種和溶果膠亞種[12]。殺鮭亞種為殺鮭氣單胞菌的典型株,并與鮭魚的全身感染有關(guān),其他4 個亞種,以及不能歸類于5 個亞種中的任何一個的分離株通常被認為是非典型株[12]。在理化特征方面,殺鮭亞種與其他亞種之間差別較大,如葡萄糖產(chǎn)氣陽性、可以利用蔗糖、不產(chǎn)生吲哚等[12]。2013 年11 月,北京市水生野生動植物救護中心馴養(yǎng)的細鱗鮭就出現(xiàn)過背鰭基部出血、局部體表潰爛的癥狀,分離到的病原菌為殺鮭氣單胞菌無色亞種[10]。把本研究中分離到的BJSY-1 與2013年得到的殺鮭氣單胞菌進行比較,其理化特性、藥物敏感性、16S rDNA 基因序列均不同。本研究中分離得到的殺鮭氣單胞菌理化特性與殺鮭亞種的特性相符合,為了更準確地鑒定BJSY-1 的亞種,有必要通過分子生物學(xué)方法進一步確定。本研究分離的BJSY-1 的16S rDNA 基因序列與GenBank 中登錄的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種16S rDNA 基因序列一致性達到99%以上,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明,BJSY-1 株與殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種聚成一支。綜合菌株的理化特性和16S rDNA 的基因序列分析,最終確定病原菌BJSY-1 為殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種。

3.3 殺鮭氣單胞菌的耐藥性 目前國內(nèi)在水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中仍選用抗生素防治細菌感染,但同在一個環(huán)境長期使用一種抗生素會使細菌產(chǎn)生耐藥性,甚至產(chǎn)生抗生素抗性基因,出現(xiàn)耐藥株[14]。為了避免病原菌過快地對某些抗生素類藥物產(chǎn)生耐藥性,可以進一步研究殺鮭氣單胞菌的耐藥機制,并且關(guān)注養(yǎng)殖水體中致病菌耐藥性的變化趨勢,科學(xué)合理地選用藥物,避免或延緩該水體中病原菌產(chǎn)生耐藥性,也為監(jiān)測養(yǎng)殖環(huán)境和魚體中細菌耐藥性關(guān)系提供參考。本研究中藥敏試驗結(jié)果表明,殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種BJSY-1 菌株對喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺醇類等藥物高度敏感；對利福平等中度敏感；而對磺胺甲噁唑、氨芐西林、萬古霉素等具有耐藥性。這與2013 年在同一地點分離到的細鱗鮭源殺鮭氣單胞菌無色亞種對氟苯尼考高度敏感這一結(jié)果相同,但此無色亞種對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星中度敏感,與本文結(jié)果略有差異,推測是由于亞種的不同和環(huán)境的變化引起的[10]。從患病虹鱒、北極紅點鮭、美洲紅點鮭和細鱗鮭中分離到的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種均對喹諾酮類藥物高度敏感,對其他藥物的耐藥性卻不太相同[13]。本文結(jié)果與細鱗鮭源的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種BRL-15的耐藥性最為接近,對所選的絕大部分藥物均比較敏感[15]。

3.4 細鱗鮭細菌性疾病的防治 目前發(fā)現(xiàn)的細鱗鮭細菌性疾病的致病菌主要是殺鮭氣單胞菌和嗜水氣單胞菌[10,16-17],患病魚癥狀基本相同,主要感染魚苗及幼魚,發(fā)病速度快,死亡率高。 徐革鋒等[3]認為,細鱗鮭疥瘡病病原菌為殺鮭氣單胞菌,一般只感染30 g 以上的幼魚,可用鹽酸恩諾沙星10 ～15 mg/kg·bw 預(yù)防,20 ～30 mg/kg·bw 內(nèi)服治療。李海波等[4]采用聚維酮碘(10%)10 mg/L 浸泡+每100 kg 飼料加50 g 維西安和250 g 產(chǎn)酶益生素內(nèi)服,治療細鱗鮭爛鰭病。本試驗根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果,選取了鹽酸多西環(huán)素、磺胺對甲氧嘧啶二甲氧芐啶、頭孢曲松鈉、環(huán)丙沙星和氟苯尼考治療感染了殺鮭氣單胞菌的細鱗鮭,其中口服氟苯尼考對患病細鱗鮭的治療效果最佳,除了在投喂藥餌第一天有一條魚死亡外,之后再沒有死亡情況；浸浴鹽酸多西環(huán)素的效果次之,浸浴4 d 后,細鱗鮭也基本停止死亡。此結(jié)果可為細鱗鮭養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌的早期預(yù)防和治療提供一定的參考。此次患病的細鱗鮭個體很小,外觀癥狀有的并不嚴重,但發(fā)病時間短,死亡率高。在細鱗鮭細菌性疾病的預(yù)防和治療中,應(yīng)該科學(xué)篩選敏感藥物,有針對性的用藥,并根據(jù)藥物的特性進行多種藥物的聯(lián)合使用,再配合溫和的水體消毒及魚類免疫增強劑,達到防治細菌感染的目的。