景俊年，蘇金輝，夏 冰，王九峰

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀100193)

斷奶仔豬面臨斷奶應激和突然轉變?yōu)橹参镲暳蠟橹鞯娜占Z等多重因素的影響,常常會引起早期斷奶仔豬采食量降低、生長遲滯、消化功能紊亂等一系列征候,被稱為早期斷奶應激綜合征(Piglets Early-weaning Synodrome,PEWS)[1-3]。這其中飼料中天然抗原的負面作用是重要因素,其中豆粕中大豆抗原蛋白及其他抗營養(yǎng)因子常常是重要原因[4-5]。仔豬對大豆抗原產(chǎn)生免疫反應,引起小腸形態(tài)結構的變化,從而破壞仔豬腸道的免疫系統(tǒng),導致腸黏膜屏障功能受到破壞,引起仔豬腸道過敏反應[6]。高豆粕帶來的高大豆抗原是加重仔豬早期斷奶綜合征的重要因素[7]。

紫蘇被認為具有抗炎、抗過敏、抗氧化的活性,其揮發(fā)油被認為是主要有效成分[8]。紫蘇葉粗蛋白高達20%以上,含多種氨基酸,鈣磷含量較高,本身適于直接應用于飼料當中,位列“飼料原料目錄-可飼用天然植物”(農(nóng)業(yè)部公告,第1773 號)。同時紫蘇適應性較好,在全國各地均可種植。有研究表明,紫蘇葉提取物對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結腸炎癥狀具有明顯改善效果[9]。本文擬通過建立斷奶仔豬模型,系統(tǒng)研究豆粕中的大豆抗原對仔豬的臨床及病理變化等以及紫蘇葉油浸劑在該過程中所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 21 日齡斷奶仔豬18 頭,體重6 kg 左右,雌雄各半。分空白對照組(CN 組)、高豆粕組(HS 組)、高豆粕加紫蘇葉油浸劑保護組(PL組)；隨意采食,自由飲水。

1.1.2 紫蘇葉油浸劑 新鮮紫蘇葉、豆油按3∶1混合后添加6%蔗糖脂肪酸酯至100%混合浸潤后濕磨粉碎,30 目去除渣滓,加1.5 倍的膨化玉米制成吸附粉。

1.1.3 試驗日糧 見表1。

表1 各組試驗日糧及營養(yǎng)水平

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀觀察及記錄 試驗期間觀察并記錄各組仔豬的臨床癥狀,每日早晚(8:00；20:00)各測量一次體溫并記錄,觀察記錄每頭豬排出的糞便并評分。

1.2.2 糞便中腸炎標志物檢測 髓過氧化物酶(MPO),α1 抗胰蛋白酶(α1AT),檢測試劑盒,購自南京建成生物科技有限公司；新喋呤(NP)檢測試劑盒,購自江萊生物科技有限公司；檢測方法按照說明書進行。

1.2.3 組織病理切片制作及腸炎評級 仔豬屠宰后不擠壓采集豬空腸、回腸各一段(約2 cm),涮洗去除腸道內(nèi)容物,置于盛有4%多聚甲醛固定48 h。組織塊經(jīng)脫水,透明,浸蠟形成蠟塊,置于切片機上制作厚度為3 μm 的切片,蠟帶進行展片和烤片后進行蘇木精-伊紅(H.E.)染色。將制備好的腸道切片置于顯微鏡下觀察,針對每頭豬空腸、回腸的病理變化評估其腸炎情況。

2 結果

2.1 臨床癥狀 試驗期間每日測量試驗豬直腸溫度,各組仔豬直腸溫度有升高的趨勢,但是都維持在正常體溫之內(nèi),之后各組仔豬直腸溫度維持在39 ℃左右,各組仔豬體溫無顯著差異。

于試驗周期內(nèi)每日8:00、20:00 觀察仔豬糞便狀態(tài)并按照評分標準進行評價,評分為1 ～3 級時判定為未發(fā)生腹瀉,4 ～6 級時判定為腹瀉,統(tǒng)計試驗期各級糞便所占比例,結果如圖1 所示。

圖1 腹瀉比例

試驗開始1 ～2 d,各組仔豬受斷奶應激、運輸應激及環(huán)境應激影響,出現(xiàn)輕微腹瀉狀況。經(jīng)過統(tǒng)計學分析,HS 組腹瀉頻率顯著高于CN 組,而PL 組與CN 組沒有顯著差異。

2.2 腸炎標志物檢測 分別于第1、3、5、7 天無菌采集糞便,檢測糞便中腸炎標志物髓過氧化物酶(MPO),α1 抗胰蛋白酶(α1AT),新喋呤(NP)水平。

圖2 髓過氧化物酶MPO 表達水平

MPO 是評價炎癥嚴重程度的重要指標,在第3天,與CN 組相比,HS 組MPO 水平有極顯著性升高,而PL 組有顯著性升高,同時HS 組顯著高于PL 組；在第5 天,HS 組MPO 水平除顯著高于CN 組外,也顯著高于PL 組；在第7 天,與CN 組相比,HS 組合PL均有極顯著性升高,同時,HS 組顯著高于PL 組。

圖3 α1 抗胰蛋白酶(α1AT)表達水平

α1AT 是抗炎癥的急性期反應物,在第3、5 天,與CN 相比,HS 組有顯著性升高,而PL 則沒有顯著性變化,同時HS 組也顯著高于PL 組。

NP 與機體細胞免疫活化及炎癥反應狀態(tài)有關,在本試驗期間,三組仔豬均沒有顯著性變化。

2.3 腸道病理變化 屠宰后采集三組仔豬空腸、回腸樣本制作石蠟切片,H.E.染色后觀察,結果見封三彩版圖4。

CN 組仔豬空腸無明顯病變情況。HS 組仔豬空腸絨毛高度低于CN 組,鏡下可見腸上皮細胞大量壞死脫落,腸絨毛斷裂,黏膜充血顯著,固有層出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤及細胞壞死。PL 組空腸絨毛結構完整,黏膜有輕度充血,固有層有少量炎性細胞浸潤。

鏡下觀察發(fā)現(xiàn),CN 組回腸絨毛結構完整清晰,HS 組回腸上皮細胞壞死脫落,腸絨毛斷裂明顯,杯狀細胞明顯增多,黏膜中度充血,PL 組回腸絨毛結構完整清晰,杯狀細胞輕微增多,固有層有少量炎性細胞浸潤,黏膜輕度充血。CN 組回腸淋巴小結結構清晰正常,無明顯病變,HS 組回腸淋巴小結內(nèi)有大量細胞壞死崩解,淋巴濾泡排空現(xiàn)象明顯,PP結呈重度“星空樣變”,PL 組回腸淋巴小結內(nèi)有輕微淋巴細胞壞死現(xiàn)象,PP 結呈輕度“星空樣變”。與HS 組比較,PL 組回腸病變程度明顯減輕,說明添加紫蘇葉對大豆抗原引起的仔豬腸炎有一定的保護作用(見封三彩版圖5)。

按照試驗方法所述腸炎評級標準對各組試驗仔豬腸炎發(fā)生情況進行評級,結果見圖6。

通過腸炎評分結果可知,空腸HS 組與其余兩組的差異主要體現(xiàn)在黏膜下層水腫,回腸HS 組與其余兩組的差異主要體現(xiàn)在黏膜下層充血和中央乳糜管水腫兩項。在空腸和回腸,HS 組與CN 組腸炎評分均存在顯著差異,說明高豆粕大豆抗原可引起仔豬腸道炎癥。比較HS 組與PL 組可知,回腸中兩組間腸炎評級分數(shù)存在顯著差異,說明添加紫蘇葉可以緩解大豆抗原引起的回腸腸道炎癥,而在空腸中,雖然PL 組與HS 組腸炎評級分數(shù)差異不顯著,但其炎癥程度低于HS 組,說明添加紫蘇葉減輕腸道炎癥的主要部位在回腸。

3 討論

豆粕作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源,廣泛應用于仔豬的斷奶飼糧,但是其中的大豆抗原蛋白是主要的致敏因子,會影響動物機體對營養(yǎng)成分的吸收,使得仔豬出現(xiàn)腸道炎癥反應,導致仔豬免疫功能紊亂、腸道形態(tài)損傷、生長抑制以及腹瀉,嚴重者可導致死亡等[10-11]。大豆抗原會誘發(fā)仔豬的過敏反應,主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型過敏反應[12],當大豆抗原被采食后,3 種過敏反應均會發(fā)生,而且Ⅰ型會促進Ⅲ型過敏反應的發(fā)生[13]。綜合臨床癥狀、腸炎標志物、腸道病理變化等結果,我們發(fā)現(xiàn)高大豆抗原可以明顯引起仔豬的炎癥,這與之前的結果是一致的[14]。

圖6 仔豬腸炎評分

在試驗期間,我們發(fā)現(xiàn)HS 組腹瀉率顯著高于CN 組,而PL 組與CN 組沒有差異,說明豆粕中的大豆抗原可以引起仔豬腹瀉,而添加紫蘇葉一定程度上能減輕大豆抗原引起的腹瀉。在第3、5、7 天,HS組MPO 水平顯著高于CN 組和PL 組,說明HS 組存在炎癥,需要借助嗜中性粒細胞來清除體內(nèi)的炎癥。α1AT 是動物血漿中最重要的蛋白酶抑制劑,能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽酶,如嗜中性粒細胞彈性蛋白酶,其主要作用是保護機體正常細胞和器官不受蛋白酶的損傷,抑制感染和炎癥,維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡,是抗炎癥的急性期反應物。在第3,5 天,HS 組高于CN 組和PL 組,這與MPO 結果相似。

在空腸,HS 組表現(xiàn)出明顯的上皮細胞壞死、炎性細胞浸潤及黏膜下層水腫等病理變化,添加紫蘇葉可以顯著減緩黏膜下層水腫程度。在回腸,HS 組表現(xiàn)出明顯的上皮細胞壞死、炎性細胞浸潤、中央乳糜管水腫、黏膜下層水腫、黏膜充血和淋巴濾泡排空,添加紫蘇葉可以顯著減緩黏膜下層水腫程度、改善黏膜充血狀況。腸炎評級結果顯示,在空腸和回腸,HS 組與CN 組腸炎評分均存在顯著差異,說明豆粕中的大豆抗原可以造成腸道炎癥,回腸的腸炎(12.67)評分高于空腸(7.83),說明大豆抗原引起腸炎的主要作用部位發(fā)生在回腸。在回腸,PL 組腸炎評分與HS 組存在顯著性差異,而空腸差異不顯著,這說明添加紫蘇葉起到的保護性作用主要發(fā)生在回腸。