1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530023

壯藥清解霧化液為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在研醫(yī)療機構(gòu)制劑，由桑葉、千里光、崗梅根、一點紅等壯藥材組方，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽的功效[1]。經(jīng)查閱文獻，組方藥材中的化學(xué)成分包括生物堿、黃酮類和咖啡?？鼘幩犷惖萚2-4]，本文對其主要有效成分為蘆丁、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷進行研究，建立RP-HPLC同時測定4種指標成分的含量測定方法，為完善壯藥清解霧化液質(zhì)量標準提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GH-25電子分析天平(日本A&D公司)； CD-UPT超純水機(成都越純科技有限公司)；H1650醫(yī)用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 試藥 崗梅根、一點紅、千里光、桑葉藥材(由廣西南寧萬寶堂藥業(yè)提供)，經(jīng)廣西中醫(yī)大學(xué)田輝教授鑒定符合2015年版《中國藥典》一部各品種項下標準。綠原酸(批號：110753-201413)、蘆丁(批號：100080-201409)、金絲桃苷(批號：111521-201405)、異槲皮苷(批號：111809-201402)等對照品購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：WondaCractODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈溶液(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(見表1)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：355 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。色譜圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫時間程序

2.2 供試品溶液 精密移取壯藥清解霧化液25 mL，水浴蒸干，甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，超聲處理30 min，放冷，精密加入甲醇定容至刻度線，搖勻，10000 /min離心5 min，取上清液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得壯藥清解霧化液供試品。

2.3 陰性對照溶液 按照壯藥清解霧化液組方工藝配制缺少千里光的陰性樣品，再按“2.2”項下方法制備缺千里光陰性對照液；同上配制缺少一點紅、千里光、桑葉的陰性樣品，制備缺一點紅、千里光、桑葉陰性對照樣品。

2.4 混合對照溶液 精密稱取對照品綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷，加甲醇溶解制成對照品母液。再精密依次吸取一定體積對照品母液于同一容量瓶，甲醇定容得濃度依次為0.2220 mg/mL、0.033 mg/mL、0.0208 mg/mL、0.03485 mg/mL的混合對照品溶液,0.45 μm濾膜濾過備用。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對照品溶液10、12、15、18、20、25 μL，分別進樣分析。以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標進行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷回歸方程及線性范圍

2.6 精密度考察 取“2.2”項下壯藥清解霧化液供試品溶液，連續(xù)6次進樣20 μL，依法測定記錄綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積，RSD依次為1.4%,1.7%,2.2%,1.2%,表明精密度良好，達到測定要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取壯藥清解霧化液供試品溶液，分別于室溫下0, 4, 8, 12, 24, 36 h進樣20 μL，依法測定，記錄綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積，RSD分別為1.9%，2.4%，2.9%，1.8%，說明壯藥清解湯供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，達到測定要求。

2.8 重復(fù)性試驗 按照“2.2”項下壯藥清解霧化液供試品制備方法，平行制備壯藥清解霧化液供試品溶液6份，按照2.1項的色譜條件進行測定，結(jié)果綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.1948、0.0214、0.0204、0.0280 mg/mL，RSD依次為2.0%,2.5%,2.7%,1.8%，參照2015年版《中國藥典》四部藥品質(zhì)量標準方法驗證指導(dǎo)原則準確度項下樣品待測定成分含量和回收率限度要求，待測定成分含量0.01%，重復(fù)性RSD可接受范圍為小于4，良好，達到測定要求。

2.9 加樣回收率考察 精密移取已測定含量的壯藥清解湯6份各10 mL,分別精密加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷混合對照品溶液適量，按照“2.2”項下壯藥清解湯供試品制備方法液,按“2.1”項色譜條件測定, 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷回收率在96.7%～103.5%,結(jié)果見表3。參照2015年版《中國藥典》四部藥品質(zhì)量標準方法驗證指導(dǎo)原則準確度項下樣品待測定成分含量和回收率限度要求，待測定成分含量0.01%，回收率限度(%)范圍為85～110；結(jié)果表明，符合含量測定的要求。

表3 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的加樣回收率 (n=6)

2.8 樣品含量測定 按既定工藝制3 批壯藥清解湯樣品，每批樣品按“2. 2”項下方法分別制備 3 份壯藥清解湯供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的標準曲線，計算各成分含量。結(jié)果見表 4。

表4 壯藥清解湯中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

壯藥清解霧化液處方包括壯藥材桑葉、千里光、崗梅根、一點紅；組方藥材均為功效類似狀藥，具有相同的有效成分。經(jīng)文獻查閱，一點紅、桑葉均含有綠原酸、蘆丁、異槲皮苷，千里光含金絲桃苷、綠原酸、蘆丁、槲皮素等[2-4]。本研究通過保留時間和千里光專屬成分金絲桃苷為參照的相對保留時間共同確定綠原酸、蘆丁、異槲皮苷的色譜峰。

檢測波長與流動相的確定：參照2015年版《中國藥典》，千里光含量測定項金絲桃苷檢測波長360 nm；綠原酸檢測波長是327 nm；蘆丁與異槲皮苷的苷元都是槲皮素，在358 nm有最大吸收；結(jié)合試驗測定以355 nm作為檢測波長[5]。以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫；試驗中混合對照品和壯藥清解霧化液中四種成分均達到基線分離，基線平穩(wěn)，峰型對稱，色譜峰分離度大。本研究對壯藥清解霧化液3個批次進行含量測定，4個成分含量差異較小，說明壯藥清解霧化液質(zhì)量穩(wěn)定。

綜上，本研究建立的方法穩(wěn)定、準確，重復(fù)性強，可為壯藥清解霧化液質(zhì)量控制提供參考。