劉東涌

[摘要] 目的 探討人端粒酶TERT蛋白與P16蛋白免疫組化檢測(cè)在宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 方法 方便選取2016年2月—2018年2月于該院就診并經(jīng)病理確診的91例CIN患者及29例宮頸癌（Ca）作為研究對(duì)象，另選取同期健康女性20名作為對(duì)照組。91例CIN患者經(jīng)病理證實(shí)為CIN I級(jí)20例，CIN II級(jí)38例，CIN III級(jí)33例。所有患者TCT、HPV檢查陰性，采集標(biāo)本組織檢測(cè)hTERT及P16表達(dá)情況，總結(jié)hTERT、P16在宮頸病變中的表達(dá)特點(diǎn)及臨床檢測(cè)價(jià)值。結(jié)果 對(duì)照組、CIN I、II、III級(jí)、Ca患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率分別為5.00%、15.00%、60.53%、72.73%、96.55%，P16表達(dá)陽(yáng)性率分別為10.00%、15.00%、73.68%、78.79%、100.00%。Ca、CIN II、III級(jí)患者h(yuǎn)TERT蛋白、P16陽(yáng)性率明顯高于CIN I級(jí)患者與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且Ca患者h(yuǎn)TERT蛋白、P16陽(yáng)性率明顯高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 宮頸癌、CINIII、CINII組織中P16、端粒酶TERT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均異常升高，表明其與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，可作為CIN分級(jí)與宮頸癌診斷、治療評(píng)估的重要指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 人TERT蛋白;P16蛋白;免疫組化檢測(cè);宮頸上皮內(nèi)瘤變;宮頸癌

[中圖分類號(hào)] R737? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-0742（2019）05（a）-0037-03

[Abstract] Objective To investigate the value of human telomerase TERT protein and P16 protein immunohistochemical detection in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia （CIN）. Methods A total of 91 CIN patients and 29 cases of cervical carcinoma diagnosed by pathology in our hospital from February 2016 to February 2018 were selected as the research objects， and 20 healthy women in the same period were selected as the control group. There were 91 CIN patients who were pathologically confirmed as CIN I in 20 cases， CIN II in 38 cases and CIN III in 33 cases. All patients examined the TCT and HPV. Specimens were collected to detect the expression of hTERT and P16. And the expression characteristics and clinical detection value of hTERT and P16 in cervical lesions were summarized. Results The positive rates of hTERT protein in control group of CIN I， II， III and Ca patients were 5.00%， 15.00%， 60.53%， 72.73%， 96.55%， and the positive rates of P16 expression were 10.00%， 15.00%， 73.68%， 78.79% and 100.00%， respectively. The positive rates of hTERT protein and P16 in Ca， CIN II and III patients were significantly higher than those in CIN I and control group （P<0.05）， and the positive rates of hTERT protein and P16 in Ca patients were significantly higher than those in other groups （P<0.05）， with statistically significant differences. Conclusion The positive expression rates of P16 and telomerase TERT protein in cervical cancer， CINIII and CINII tissues were all significantly increased， indicating that they are closely related to the occurrence and development of cervical cancer and can be used as an important indicator for CIN classification， diagnosis and treatment evaluation of cervical cancer.

[Key words] Human TERT protein; P16 protein; Immunohistochemical detection; Cervical intraepithelial neoplasia; Cervical cancer

宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是一種正常宮頸組織向?qū)m頸癌發(fā)展的特殊過(guò)程，通常分為CINI、CINII、CINIII，若不進(jìn)行及時(shí)檢查、診斷及治療，可能逐漸進(jìn)展，最終可能發(fā)展成為宮頸浸潤(rùn)癌，嚴(yán)重影響患者生存期及生活質(zhì)量[1]。相關(guān)臨床研究表明，CIN是基于針對(duì)性治療可有效推延、阻遏、逆轉(zhuǎn)宮頸病變但由于CIN缺乏典型的臨床癥狀，患者出現(xiàn)癥狀就診時(shí)可能已進(jìn)展為原位癌，甚至浸潤(rùn)癌，此期即使接受治療往往預(yù)后也較差，因此研究CIN早期篩查及診斷方法具有重要的臨床意義[2-3]。該組研究通過(guò)對(duì)2016年2月—2018年2月于該院就診的91例CIN患者、29例宮頸癌及20例健康女性進(jìn)行對(duì)照研究，探討人端粒酶TERT蛋白與P16蛋白免疫組化檢測(cè)在宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）診斷中的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1? 資料與方法

1.1? 基礎(chǔ)資料

方便選取該院就診并經(jīng)病理確診的91例CIN患者及29例宮頸癌（Ca）作為研究對(duì)象，另選取同期健康女性20名作為對(duì)照組。91例CIN患者經(jīng)病理證實(shí)為CIN I級(jí)20例，CIN II級(jí)38例，CIN III級(jí)33例，患者年齡35～51歲，平均年齡（42.7±4.0）歲，宮頸癌患者年齡38～55歲，平均年齡（45.2±4.7）歲，對(duì)照組為同期子宮肌瘤手術(shù)患者，年齡31～59歲，平均年齡（40.2±5.9）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者對(duì)該組研究?jī)?nèi)容完全知情同意書;已通過(guò)該院倫理道德委員會(huì)審核;經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷為CIN及宮頸癌;所有患者行TCT、HPV篩查;對(duì)照組因其他非宮頸病變切除全子宮，且術(shù)后病理證實(shí)無(wú)宮頸病變;無(wú)放療、化療治療史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤;HPV感染患者;無(wú)病理學(xué)診斷資料;接受放療、化療治療。

1.2? 研究方法

1.2.1? 試劑與儀器? 鼠抗人P16INK4A蛋白單克隆抗體（福州邁新生物公司）;免疫組化SP法試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）;ELX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）

1.2.2? 檢測(cè)方法? 采用免疫組化SP法檢測(cè)病變組織hTERT、P16蛋白表達(dá)情況，完全按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，①制片：將包有子宮頸組織的蠟塊放在切片機(jī)上，對(duì)組織塊進(jìn)行4～6 μm厚度切片，并置于45℃蒸餾水中展片，自然晾干后，將所需玻片放入60℃烤片機(jī)內(nèi)30 min以上;②脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯I-二甲苯II-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精;③阻斷：玻片中添加SP試劑盒中試劑A，孵育10 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;PBS沖洗2～3次，5 min/次;④抗原修復(fù)：置于0.01枸櫞酸緩沖液中煮沸5 min后自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗罐子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗2～3次，每次5 min;⑤封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不必沖洗;⑥滴加I抗50 μL，4度冰箱過(guò)夜;隔日從冰箱取出，室溫靜置1 h，PBS沖洗2～3次，5 min/次;⑦滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的II抗50 μL，室溫靜置10 min，PBS沖洗2～3次，5 min/次;⑧滴加鏈霉素親和素-過(guò)氧化物酶，室溫孵育10 min，PBS沖洗2～3次，5 min/次;⑨顯色：DAB顯色10 min，在顯微鏡下掌握染色程度;自來(lái)水沖洗10 min終止反應(yīng);⑩復(fù)染：蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗10～15 min;常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。

1.3? 觀察指標(biāo)

P16INK4A蛋白表達(dá)情況，當(dāng)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒則為染色陽(yáng)性細(xì)胞并采用半定量法評(píng)價(jià)P16INK4A蛋白表達(dá)強(qiáng)度，其中陰性為陽(yáng)性細(xì)胞比例低于10%，弱陽(yáng)性（+）為陽(yáng)性細(xì)胞比例10～30%且顏色呈棕黃色，陽(yáng)性（+ +）則為陽(yáng)性細(xì)胞比例31～70%，顏色為棕黃色，強(qiáng)陽(yáng)性（+ + +）陽(yáng)性細(xì)胞比例超過(guò)70%且顏色呈棕褐色。

hTERT蛋白主要定位于細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)，鏡下以出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性。采用半定量積分法判定結(jié)果，先按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分，無(wú)色;1分，淺黃色;2分，棕黃色;3分，棕褐色。再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0分，陰性;1分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%;2分，25%～<50%;3分，50%～<75%;4分，≥75%。兩項(xiàng)得分相乘后判定免疫組化結(jié)果，分為陽(yáng)性和陰性兩組，0～4分為（-）組，≥4分為（+）組。

1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料[n（%）]采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 各組hTERT蛋白表達(dá)情況比較

Ca、CIN II、III級(jí)患者病變組織hTERT蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN I級(jí)與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ca患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN II、III級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），雖然CIN I級(jí)患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率略高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2? 各組P16蛋白表達(dá)情況比較

Ca、CIN II、III級(jí)患者病變組織P16蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN I級(jí)與對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Ca患者P16蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN II、III級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），雖然CIN I級(jí)患者P16蛋白陽(yáng)性率略高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3? 討論

hTERT蛋白分子主要分布于細(xì)胞核中，其作為端粒酶催化亞基可用于維持端粒長(zhǎng)度，同時(shí)在維持端粒結(jié)構(gòu)完整性方面同樣具有重要的作用，既往研究表明[4]，hTERT蛋白能夠直接參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，而近年來(lái)有報(bào)道通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)hTERT表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)端粒酶活性受到明顯抑制，并且腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射、化療藥物的敏感性發(fā)生不同程度的增加，間接證明hTERT蛋白分子的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系[5-6]。而該組研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、CIN I、II、III級(jí)、Ca患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率分別為5.00%、15.00%、60.53%、72.73%、96.55%，P16表達(dá)陽(yáng)性率分別為10.00%、15.00%、73.68%、78.79%、100.00%。Ca、CIN II、III級(jí)患者病變組織hTERT蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN I級(jí)與對(duì)照組，Ca患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN II、III級(jí)患者，雖然CIN I級(jí)患者h(yuǎn)TERT蛋白陽(yáng)性率略高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著差異，結(jié)果提示隨著CIN等級(jí)的提升，hTERT蛋白陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì)，表明hTERT蛋白陽(yáng)性水平與宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸癌的發(fā)生具有密切聯(lián)系[7]。

而P16INK4A蛋白作為一種腫瘤抑制基因，對(duì)腫瘤周期具有一定的調(diào)控能力，能夠與細(xì)胞周期蛋白CDK4、CDK6相互作用并阻斷其與細(xì)胞周期蛋白D1的結(jié)合，從而阻止Rb磷酸化、導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G1期，局部細(xì)胞無(wú)限增殖而形成腫瘤[8]。近年來(lái)腫瘤病理生理學(xué)研究表明[9]，組織細(xì)胞癌變的發(fā)生與發(fā)展是多基因共同作用的結(jié)局，而P16INK4A基因作為腫瘤周期調(diào)控因子，其確實(shí)直接可導(dǎo)致細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞在未成熟的狀態(tài)下分離形成永生化，因此國(guó)內(nèi)外已將P16INK4A基因作為宮頸病變的重要生物學(xué)行為及預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)[10]，而該組研究結(jié)果顯示Ca、CIN II、III級(jí)患者病變組織P16蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN I級(jí)與對(duì)照組，Ca患者P16蛋白陽(yáng)性率明顯高于CIN II、III級(jí)患者，雖然CIN I級(jí)患者P16蛋白陽(yáng)性率略高于對(duì)照組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)顯著差異，結(jié)果提示隨著宮頸病變的發(fā)展，患者P16INK4A蛋白的表達(dá)水平隨之升高，其對(duì)宮頸病變的診斷與病情評(píng)估具有重要意義。

綜上所述，宮頸癌組織中P16、端粒酶TERT蛋白表達(dá)陽(yáng)性率異常升高，其與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，可作為CIN分級(jí)與宮頸癌診斷、治療評(píng)估的重要指標(biāo)。

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（收稿日期：2019-01-27）