王 歡，張 莉，李齊光，苗澤方，汪 晟，張小葵*，黃建軍*

（山東大學威海校區(qū)，海洋學院·山東威?！?64209）

紅豆杉又名紫杉、赤柏松,紅豆杉科紅豆杉屬，常綠喬木或灌木,屬第四世紀冰川后的世界級珍稀瀕危資源，1999年被列為中國一級保護植物[1]。20世紀60年代，美國科學家從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)樹皮中提取分離得到一種抗癌活性較強,作用機理特殊的物質，稱為紫杉醇；紫杉醇的作用機理是通過影響癌細胞的細胞周期，從而抑制腫瘤細胞的有絲分裂[2]，進一步阻止癌細胞增殖和遷移。紫杉醇的發(fā)現(xiàn)使癌癥治療取得重大進展[3]。但紫杉醇在紅豆杉中的含量較低，即使當前公認含量最高的短葉紅豆杉,其樹皮中的紫杉醇也僅含有0.069%[4],且僅有30年以上樹齡的紅豆杉才存在開發(fā)價值[5]。

現(xiàn)代藥理學研究表明，紅豆杉除了含有抗腫瘤成分紫杉醇外，還含有其他具有抗炎性反應[6]，抗微生物[7]，抗骨質疏松[8]，降低血糖濃度[9]和抗氧化[10]等多種藥理作用的化合物成分。

1 材料與儀器

1.1 原料

山東紅豆杉 （山東威海榮成天一紅豆杉種植公司提供）。

1.2 試劑

甲醇（分析純、色譜純）；三氯甲烷（分析純）等。

1.3 儀器

電子天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；粉碎機（浙江榮浩工貿(mào)有限公司）；恒溫水浴鍋（龍口市先科儀器公司）；旋轉蒸發(fā)儀（鄭州科泰實驗設備有限公司）；旋渦混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；超聲波清洗器（SK8210LHC,上?？茖С晝x器有限公司）；低速離心機（SC3610,科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；島津三重四級桿液相色譜質譜聯(lián)用儀（LCMS-8040），包括在線真空脫氣機（DGU-20A3R），二元高壓泵（LC-20ADXR）、自動進樣器（SIL-20AXR）、柱溫箱（CTO-20A）、三重四級桿串聯(lián)質譜儀、工作站 （LabSolutions LCMS Version 5 for LCMS-8040）。

2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀

紅豆杉屬植物全世界有11個種，我國有4種1變種，即東北紅豆杉 Taxus cuspidata Sieb．et Zucc．云南紅豆杉 Taxus yunnanensis Cheng et L．K．Fu．西藏紅豆杉Taxus wallichiana Zucc．中國紅豆杉Taxus chinensis(Pilger)Rehd．和南方紅豆杉Taxus chinensis(Pilger)Rehd．var．mairei(變種)[11]。

東北紅豆杉的植物形態(tài)，許建聞等的研究表明，東北紅豆杉，多為灌木或喬木，樹高達20 m，直徑達1 m。樹冠倒卵形或闊卵形。樹皮紅褐色。葉生于主枝上部[12]，為螺旋狀排列，在側枝上葉柄基部扭轉向左右，排成不規(guī)則兩列。葉線形，半直或稍彎曲，長1.5～2.5 cm，寬2.5 mm，表面深綠色，有光澤[13]，種子堅果狀，具 3～4 條棱脊，假種皮杯狀，肉質紅色，9～10月果熟[14]。根表面淺紅褐色莖。枝表面密布葉柄殘基及小枝疤痕。莖栓皮常脫落,露出粉紅色內(nèi)側木栓層,或黃白色韌皮部,斷面木質部年輪密集[15]。

云南紅豆杉的植物形態(tài)，王磊等的研究表明，云南紅豆杉為常綠喬木。葉片螺旋狀排列,基部扭轉呈假二列羽狀展開。質地薄，條狀披針形,常呈鐮狀,邊緣向下外卷，尖端漸尖，長 1.5～4.7cm,寬2～3cm，葉面深綠色，中脈兩側各有一條淺黃色氣孔帶，中脈與氣孔帶上密生均勻微小角質的乳頭狀突起[16]。種子生于肉質杯狀的假種皮中，成熟后假種皮色澤鮮紅[17]。

西藏紅豆杉的植物形態(tài)，周進等的研究表明，西藏紅豆杉為灌木或喬木，樹皮灰色或紅褐色，樹干直徑約為1m；葉片小枝排列較密，成彼此重疊的不規(guī)則排列。葉線形，先端銳尖邊緣后卷，背面中脈處有大量圓形的微小突起。種子長橢圓形，長6.5～7 mm,直徑4.5～5 mm[18]。

中國紅豆杉的植物形態(tài)，費永俊等研究表明，中國紅豆杉為大灌木或喬木,樹高6～15m，最高可達30m，樹冠呈卵狀間或塔形，樹皮灰色或紅褐色，裂成薄片脫落，樹干直徑約1m。葉片呈假兩行排列，線性略呈鐮狀彎曲。長2～3cm，寬2.5～3mm腹面深綠背面黃綠，兩條褐黃色氣孔線上有微小突起。種子扁卵圓形，長5～7mm,直徑為 4～5mm[19]。

南方紅豆杉的植物形態(tài)，謝志惠等研究表明，南方紅豆杉為常綠喬木樹種，葉螺旋狀著生，基部扭轉呈二列狀，線形，微彎而近鐮刀狀，長 2～3.5cm，寬 3～4cm，先端漸尖，邊緣不卷曲，兩面中脈隆起；下面中脈兩側各有1條灰綠色或黃色的氣孔帶[20~21]。其中，1～4年生的南方紅豆杉，小枝直徑1～2mm，表面黃綠色或黃褐色，斷面黃白色，氣微，味甘，質硬，不易折斷[22]。南方紅豆杉的組織顯微觀察，王曉麗等的研究表明，木栓層2～6層細胞，切向延長緊密；木栓形成層和皮層不明顯；韌皮部10～25層細胞，每隔2～6行細胞有1橫排韌皮纖維,鑲嵌砂晶，每隔3～6列細胞有1韌皮射線，薄壁細胞和射線細胞含有淀粉粒、棕紅色內(nèi)含物及砂晶；篩胞狹長、尖斜[23～24]。

3 山東紅豆杉生物學特點

鑒于現(xiàn)有研究的研究對象集中于東北紅豆杉、南方紅豆杉等，而對于山東紅豆杉的分布及研究較少。據(jù)資料和調(diào)查顯示，山東境內(nèi)的紅豆杉種植初成規(guī)模，因此選取山東地區(qū)種植的紅豆杉進行觀察研究，旨在研究山東紅豆杉的形態(tài)特征、表層結構、紫杉醇含量等。

山東紅豆杉為曼地亞雜交種，灌木，可用種子繁殖，但出芽較慢，時間較長；現(xiàn)多用扦插繁殖，但季節(jié)性強，生根率低，繁殖速度慢。山東榮成種植的紅豆杉使用高效配套技術進行繁殖，生根率可達95%左右，25天左右開始生根，根系發(fā)達，2個月后即可出圃。對環(huán)境適應能力強，側枝分生能力強，可以長期進行采集枝葉，提煉紫杉醇。據(jù)統(tǒng)計，威海市現(xiàn)有種植紅豆杉園區(qū)主要為山東紅豆杉，比較集中的面積約3550畝，小的農(nóng)戶零星種植的山東紅豆杉面積總計1000余畝，總計約4550畝，規(guī)模如圖1、圖2所示。

山東紅豆杉在多種氣候條件下生長良好，可在光照條件差或無光照的條件下較好生長[25]。最適宜種植在排水性良好的砂質微酸性(pH值5.8～6.5)土壤中，年平均氣溫在2～7℃，年平均降水量為750～1000mm?？赡?30℃以下的低溫，抗寒性能力強。天然紅豆杉樹的紫杉醇一般分布于樹皮中，整株利用率低[26]。曼地亞紅豆杉植株各部分均含有紫杉醇，枝葉含量達0.03%以上，根系部分可達0.06%[27],全株可用于提取紫杉醇，植株利用率高。山東紅豆杉作為雜交種，其深度加工后綜合經(jīng)濟價值更高。

3.1 山東紅豆杉的植物形態(tài)

山東紅豆杉為常綠灌木。樹皮灰褐色?；▎涡?，雌雄異株。雄球花單生于葉腋，雌球花的胚珠單生于花軸上部側生短軸的頂端，基部有圓盤狀珠托。雄性花蕾比較大比較明顯，3月左右開花，給雌株授粉。雌株花蕾比較小。種子扁卵圓形，有2棱，種卵圓形，假種皮杯狀，紅色。主根不明顯,側根發(fā)達 。枝葉茂盛，萌發(fā)力強，耐修剪，生長速度快，對環(huán)境適應能力強，抗病能力強。適宜生活在氣候溫和，空氣濕度大的地區(qū)。葉長條形，多碎斷，黃綠色至暗綠色，完整者長15～35mm，寬2～4mm。葉全緣，葉先端漸尖。上面中脈隆起；下面色稍淺，中脈突起。質脆，易折斷。氣微，味苦而澀。莖呈細長圓柱形，表面黃綠色或棕色，斷面中空，詳見圖3。

3.2 顯微觀察

將山東紅豆杉葉洗凈后，切片，進行顯微觀察：從葉的橫切面可以看到，單層表皮細胞排列緊密，外被角質層，表皮由呈扁平狀單細胞構成，緊密有序排列；葉綠體含量較多，葉綠素豐富；下部的柵欄組織，由多列緊密排列的柵欄組織細胞構成；海綿組織多為橢圓形細胞構成。中脈易見微小突起，韌皮部外部維管束和木質部薄壁細胞周圍略有棕色塊，詳見圖4。

將山東紅豆杉莖切片做成裝片，進行顯微觀察：從莖的橫切面可以觀察到表皮由排列整齊的1列細胞構成；皮層是由不規(guī)則的3～5層薄壁細胞構成，排列松散；緊挨著的韌皮部細胞排列松散，呈扁平狀；木質部是有3～5層，導管呈輻射狀排列，木射線約為1列細胞，髓部較大。內(nèi)含物位于栓內(nèi)層與形成層之間的髓鞘，形狀不規(guī)則，詳見圖5。

4 理化性質

4.1 山東紅豆杉中紫杉醇的提取

山東紅豆杉葉片干燥后粉碎，進行紫杉醇的粗提。粗提階段主要目的在于選擇合適的提取溶液。在本實驗中，采用甲醇提取紅豆杉葉片中的紫杉醇物質[28]。

4.1.1 將紅豆杉枝葉放入烘干粉碎，取3g葉片粉末。

4.1.2 將粉末倒入圓底燒瓶內(nèi)，加入60ml甲醇，置于70℃恒溫水浴鍋中冷凝回流2h，收集溶液。

4.1.3 繼續(xù)加入30ml甲醇置于70℃恒溫水浴鍋中冷凝回流1h。收集溶液。

4.1.4 重復操作（3）1 次。

4.1.5 將收集到的所有溶液于30℃旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至60ml。

4.1.6.加等體積的正己烷，棄上層液，萃取4次。

4.1.7 將得到的溶液于30℃旋轉蒸發(fā)儀中濃縮至15ml。

4.1.8 用0.45μm濾膜對甲醇提取液進行過濾，即得到供試品粗提液。

4.2 薄層色譜TLC

薄層色譜（Thin Layer Chromatography）是分離紅豆杉紫杉醇的常用方法。通過提取液的濃縮，然后在硅膠板上進行點樣，在紫外燈下進行紫杉醇的定位。樣品位置與標準樣進行對照。薄層色譜操作方便，設備簡單，分離速度快，靈敏度較高，樣品用量少[29]，已廣泛應用于天然化合物的分離與鑒定。薄層色譜主要以硅膠為固定相的層析，依據(jù)組分之間的極性差異[30]。當組分與固定相親和力強時，組分與原點位置較近；反之，樣品在薄層板上移動距離遠[31]。薄層層析的技術關鍵是固定相的選擇和展開劑極性的設定。確定待測組分的比移值（Rf）[32]。在本實驗中，以硅膠為固定相，對山東紅豆杉進行薄層色譜試驗。

4.2.1 取紫杉醇標準品1.8mg，溶于800μL甲醇溶液，配置成紫杉醇標準品2mg/ml。

4.2.2 按照三氯甲烷：甲醇=12：1的比例配置展開劑，用毛細管分別吸取樣品液和標準液，在硅膠板上進行點樣，放入層析杠中進行展開。

4.2.3 待展開劑跑到硅膠板的3/4時，取出硅膠板，標記好溶劑前沿，置于254nm三用紫外燈下進行觀察，比較標準品和樣品位置，計算 Rf值[33～34]。

4.3 HPLC-MS

高效液相色譜 （High Performance Liquid Chromatography,HPLC）是一種藥物鑒別技術。以液體為主要流動相，通過高壓輸液系統(tǒng)，將隔離緩沖液和混合溶劑泵入色譜柱[35]。在流動相和色譜柱確定的條件下，每種物質或藥品具有其獨特的保留時間[36]。

液相色譜-質譜聯(lián)用是高效液相色譜與質譜的聯(lián)合，兼具液相色譜法與質譜分析的優(yōu)點，即樣品的凈化和確證分析；前者可以除去樣品的雜質，后者可以通過離子碎片的質荷比信息確認紫杉醇的含量[37]。

色譜條件：EclipsePlus C18色譜柱（2.1×50 mm i.d.，1.8μm)；流動相：5mmol/L 乙酸銨含 0.02%甲酸（A）-乙腈 （B）； 線性梯度洗脫程序：0～15min， 流速：0.2m L/min；進樣量：10μL。

質譜條件：ESI電離源；正離子掃描；霧化器流量：3L/min。干燥器流量：15.0L/min。DL溫度：250℃。加熱塊溫度：400℃。檢測器電壓：1.94k。

對照品儲備液的制備：稱取紫杉醇對照品1.3mg，用70%乙腈溶解，制得濃度1 mg·m L-1標準品溶液。

樣品溶液的制備：山東紅豆杉甲醇粗提物于旋轉蒸發(fā)儀中蒸干，用70%乙腈溶液進行溶解。

5 結果

5.1 薄層色譜

觀察到在紫杉醇標準品同一位置有相同的斑點，詳見圖6，Rf值為0.60。表明山東紅豆杉葉片中含有紫杉醇。

5.2 標準曲線的制備

取紫杉醇對照品分別配置成0.050、0.125、0.250、0.500、1mg·m L-1。 各進樣 10μl，以峰面積為橫坐標，濃度為縱坐標，紫杉醇標準曲線回歸方程：Y=1.27901E+006*X+611904（r=0.984）。

5.3 液相色譜-質譜聯(lián)用測試結果

在前述液質條件下進樣，全離子掃描一級質譜時，已知紫杉醇分子量為854，所以設置分子量范圍m/z 50-900；碰撞電壓20-22V，MRM掃描Q1。得的紫杉醇標準品前體離子LC-MS圖譜，詳見圖7。

選擇前體離子掃描時，設定m/z=854，采用數(shù)據(jù)依賴模式（DDA）進行二級質譜掃描，裂解能為23%。得到紫杉醇標準品產(chǎn)物離子的LC-MS圖譜，詳見圖8。

在上述實驗條件下分別進樣山東紅豆杉的樹皮，莖和樹葉，測得樹皮的紫杉醇濃度為38.838mg/kg；莖的紫杉醇濃度為0.482mg/kg；葉的紫杉醇濃度為5.082mg/kg。

6 討論與展望

南方紅豆杉葉片較東北紅豆杉和山東紅豆杉寬且長。山東紅豆杉較東北紅豆杉較長。南方紅豆杉中脈向上突出，薄壁細胞中含草酸鈣砂晶及紅棕色物。山東紅豆杉中脈微向下突出，薄壁細胞中紅棕色物及草酸鈣砂晶較少。為山東紅豆杉的鑒定提供一定的資料依據(jù)。

山東紅豆杉中除含有紫杉醇外，還富含7-木糖基紫杉烷類化合物，及三尖杉堿類等化合物，這些成分也存在著多種不同的藥理作用，后續(xù)實驗可結合提取方法以及色譜條件將其它成分進行提取驗證。

紅豆杉作為抗癌藥物被大力開發(fā)，而紫杉醇在紅豆杉中的含量較低，而癌癥患者數(shù)目巨大，目前每年紫杉醇的消耗量為1500～2500千克[38]，對山東紅豆杉的鑒定研究有利于其規(guī)范成藥，拓寬紫杉醇的提取原料范圍，有利于野生資源保護。山東紅豆杉作為一個新雜交種，其根系發(fā)達，適應性強，為常綠灌木，含有豐富的紫杉醇。同時，山東紅豆杉存在極高的開發(fā)價值。作為一個綠色、環(huán)保、健康的種植物，是高檔的常綠觀賞植物[39]。我國丘陵多平原少,綠化面積較小?？梢岳蒙綎|紅豆杉的生物學特性，以及在不同地區(qū)的自然資源和區(qū)位優(yōu)勢，發(fā)展山東紅豆杉經(jīng)濟林生產(chǎn)，不僅可以綠化荒山，保持水土，具有良好的生態(tài)環(huán)境效益，而且還可以通過提取紅豆杉中的紫杉醇，拉動地方的經(jīng)濟發(fā)展，從而產(chǎn)生經(jīng)濟效益。人工種植山東紅豆杉，既有生態(tài)效益、社會效益，又具有經(jīng)濟效益，是一個前景廣闊的種植產(chǎn)業(yè)。