袁樂(lè)永，王梅芳

緊密連接蛋白是存在于上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的一種蛋白質(zhì)，其作用是保持細(xì)胞間結(jié)構(gòu)的完整性。OCCLUDIN蛋白作為緊密連接蛋白的一種主要類型，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致緊密連接結(jié)構(gòu)及功能的改變，最終引起一些臨床疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)OCCLUDIN在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，且OCCLUDIN與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等有密切關(guān)系［1-4］。目前關(guān)于OCCLUDIN對(duì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的影響及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究主要通過(guò)熒光定量PCR、Western blot、CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)等方法，在體外探討OCCLUDIN對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系SPC-A1細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。OCCLUDIN siRNA、NC siRNA和Lipofectamin 2000?購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；二甲基亞砜、DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶和PBS購(gòu)自碧云天公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ASPEN ECL化學(xué)發(fā)光和顯影定影液均購(gòu)自ASPEN公司；Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、AIF、Cyt C、AKT、PI3K和內(nèi)參GAPDH一抗均為兔抗人多克隆抗體，二抗為羊抗兔，所有抗體均購(gòu)自Abcam公司；Annexin VAPC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自碧云天生物公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自德國(guó)羅氏公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將0.5×105個(gè)SPC-A1細(xì)胞接種至500μL含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%以上。實(shí)驗(yàn)分組：將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組（siCtrl組）和OCCLUDIN siRNA轉(zhuǎn)染組（siOCLN組）。具體Lipofectamin 2000?轉(zhuǎn)染siRNA配制方案見(jiàn)表1，siRNA終濃度為50 nmol/L；本研究設(shè)計(jì)2條OCLN siRNA序列，分別為5′-GGCCTCTTGAAAGTCCACCTCCTTA-3′ 和 5′-CCAAGAGCAGCAAAGGGCTTCATG-3′，同時(shí)本研究選擇1條 Ctrl siRNA 5′-CCUUUUAGGAGGUAGUGUAtt-3′，所有siRNA序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約24～48 h。

1.2.2 熒光定量PCR檢測(cè)OCCLUDIN mRNA表達(dá)水平 將SPC-A1細(xì)胞以1.0×105/mL的密度接種于96孔板，按照表1方案進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，OCCLUDIN兩條siRNA混合一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱分別孵育24 h，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。本研究使用的OCCLUDIN引物序列為，上游5′-CTCCCTGGCACCGTTGG-3′，下游5′-GGCCAACATGAAGCCCTTTG-3′。

1.2.3 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組SPC-A1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后提取蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取60μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉1 h，加入一抗，同時(shí)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，1∶5 000稀釋）為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，每次10 min。洗膜結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影。

Tab.1 SiRNA preparation program for lipofectamin 2000TMtransfection表1 Lipofectamin 2000?轉(zhuǎn)染siRNA配制方案

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組SPC-A1細(xì)胞以1.0×105/mL的密度接種于96孔板，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱分別孵育24、48、72、96、120 h，并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加入10 μL CCK-8溶液（Dojindo）；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中，1 h后于450 nm波長(zhǎng)下采用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔光密度（OD）。每組重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組SPC-A1細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取約5～10萬(wàn)個(gè)重懸后的細(xì)胞于1 000×g條件下離心5 min，棄上清，加入500μL Binding buffer對(duì)細(xì)胞進(jìn)行重懸；加入5μL Annexin V-APC染色液并輕輕混勻；繼續(xù)加入5μL 7-AAD染色液，輕輕混勻，將混合物置于室溫（20～25℃）條件下避光孵育10～20 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以右上象限（Q2）區(qū)域和右下象限（Q4）區(qū)域所占總比例作為早期與晚期凋亡細(xì)胞總百分率。每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。本研究涉及的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCCLUDIN轉(zhuǎn)染后表達(dá)鑒定及其對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖的影響 2條OCLN siRNA轉(zhuǎn)染后經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，siOCLN組OCCLUDIN mRNA水平較siCtrl組顯著降低，差異倍數(shù)為248倍。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OCCLUDIN被沉默后，siOCLN組細(xì)胞在 24、48、72、96和 120 h的光密度（OD）值較control組和siCtrl組均明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。沉默OCCLUDIN可以顯著抑制SPC-A1細(xì)胞增殖能力。

2.2 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后顯示，siOCLN組SPC-A1細(xì)胞凋亡率最高，與control組和siCtrl組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1、表3。

2.3 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Caspase途徑和AIF凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，siOCLN組Bax、caspase-3、caspase-9、AIF和Cyt C等凋亡相關(guān)蛋白較control組和siCtrl組表達(dá)明顯升高（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2較control組和siCtrl組表達(dá)明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。OCCLUDIN基因沉默可通過(guò)線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)SPC-A1細(xì)胞凋亡。

Tab.2 Effect of OCCLUDIN on the proliferation of SPC-A1 cells表2 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖的影響（n=3，OD，±s）

Tab.2 Effect of OCCLUDIN on the proliferation of SPC-A1 cells表2 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖的影響（n=3，OD，±s）

＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與siCtrl組比較，P＜0.05

組別control組siCtrl組siOCLN組F 0 h 0.25±0.02 0.24±0.02 0.23±0.01 1.000 24 h 0.64±0.09 0.63±0.08 0.38±0.05ab 11.490＊＊48 h 0.72±0.12 0.71±0.13 0.41±0.06ab 8.003＊＊組別control組siCtrl組siOCLN組F 72 h 0.94±0.16 0.92±0.14 0.54±0.08ab 8.860＊＊96 h 1.46±0.21 1.44±0.19 0.68±0.11ab 19.280＊＊120 h 1.58±0.23 1.57±0.22 0.76±0.12ab 17.22＊＊

2.4 OCCLUDIN通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)控SPC-A1細(xì)胞增殖與凋亡 siOCLN組AKT和PI3K蛋白磷酸化水平較control組和siCtrl組明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，目前是全球最為常見(jiàn)的腫瘤［5］。傳統(tǒng)放化療治療方式存在緩解率、無(wú)進(jìn)展生存期以及總生存期均較低等缺點(diǎn)。目前，分子靶向治療用于治療肺癌已成研究熱點(diǎn)，本研究主要是探尋新的靶分子，為研發(fā)靶向藥物提供依據(jù)。目前已有研究報(bào)道了OCCLUDIN在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用，其在不同腫瘤中所表現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)各不相同。Martin等［2］發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤中OCCLUDIN表達(dá)減少。朱克超等［3］檢測(cè)出OCCLUDIN在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于手術(shù)切緣正常食管黏膜組織。而Phattarataratip等［4］發(fā)現(xiàn)，有部分口腔鱗狀細(xì)胞癌患者組織標(biāo)本存在OCCLUDIN表達(dá)量升高現(xiàn)象。同時(shí) ，Rachow 等［6］發(fā) 現(xiàn) 人 皮 膚 鱗 狀 細(xì) 胞 癌 中OCCLUDIN表達(dá)正常。Bouchagier等［7］發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌組織中OCCLUDIN表達(dá)較癌旁組織明顯升高。上述研究結(jié)果提示，OCCLUDIN的表達(dá)異?？赡芘c腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)，且表現(xiàn)的生物學(xué)效應(yīng)各異。目前，OCCLUDIN在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)作用及其具體的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究結(jié)果提示OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，OCCLUDIN對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖也具有抑制作用，Someya等［8］研究顯示，OCCLUDIN在正常子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜增生和Ⅰ級(jí)子宮內(nèi)膜癌等組織中均有一定的表達(dá)量，而在Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)子宮內(nèi)膜癌組織表達(dá)量極低。本研究結(jié)果與Someya等［8］研究報(bào)道相反，推測(cè)可能是由于OCCLUDIN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制與多種因素有關(guān)，如OCCLUDIN基因沉默后可能引起抑制SPC-A1細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子表達(dá)水平升高或者促進(jìn)SPC-A1細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子表達(dá)水平降低，進(jìn)而最終引起的效應(yīng)是SPC-A1細(xì)胞的增殖被抑制。

Fig.1 Effect of OCCLUDIN on the apoptosis rate of SPC-A1 cells圖1 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡率的影響

Tab.3 Effects of OCCLUDIN on the apoptosis and signal pathway of SPC-A1 cells表3 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡與信號(hào)通路的影響 （n=3，±s）

Tab.3 Effects of OCCLUDIN on the apoptosis and signal pathway of SPC-A1 cells表3 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡與信號(hào)通路的影響 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與control組比較，b與siCtrl組比較，P＜0.05

組別control組siCtrl組siOCLN組F凋亡率（%）9.40±0.60 9.10±0.50 27.40±2.10ab 196.900＊＊凋亡相關(guān)蛋白（OD）Bax 0.48±0.06 0.47±0.05 0.64±0.09ab 5.768＊Bcl-2 0.63±0.08 0.64±0.09 0.41±0.04ab 9.447＊＊caspase-3 0.21±0.01 0.29±0.02 0.58±0.07ab 63.170＊＊caspase-9 0.42±0.04 0.38±0.03 0.60±0.08ab 13.890＊＊AIF 0.65±0.09 0.57±0.07 0.98±0.12ab 15.510＊＊Cyt C 0.18±0.01 0.17±0.01 0.71±0.09ab 103.500＊＊PI3K/Akt通路蛋白（OD）p-AKT/AKT 0.54±0.08 0.53±0.08 0.21±0.02ab 24.020＊＊p-PI3K/PI3K 0.89±0.03 0.98±0.06 0.48±0.02ab 130.500＊＊

Fig.2 Effects of OCCLUDIN on apoptosis-related protein expressions of SPC-A1 cells圖2 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Fig.3 Effects of OCCLUDIN on AKT/PI3K signaling pathway of SPC-A1 cells圖3 OCCLUDIN對(duì)SPC-A1細(xì)胞AKT/PI3K信號(hào)通路影響

本研究發(fā)現(xiàn)siOCLN組與control組和siCtrl組比較凋亡率明顯升高，siOCLN組Bax、caspase-3、caspase-9、AIF和Cyt C等凋亡相關(guān)蛋白較control組和siCtrl組表達(dá)明顯升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2較control組和siCtrl組表達(dá)明顯下降，提示OCCLUDIN基因可能通過(guò)線粒體凋亡途徑抑制SPC-A1細(xì)胞凋亡。而有研究發(fā)現(xiàn)，OCCLUDIN可通過(guò)增加癌細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性或增強(qiáng)抑癌基因的表達(dá)等方式誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡［9］，與本研究結(jié)果相反，推測(cè)可能也是與多種因素有關(guān)，如有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的白細(xì)胞介素（IL4）會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞癌（HCC）腫瘤細(xì)胞增殖和抑制其凋亡［10］，OCCLUDIN可能會(huì)對(duì)促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞的一些細(xì)胞因子表達(dá)有影響，而這些細(xì)胞因子作用于SPC-A1細(xì)胞的最終效應(yīng)可能是促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡。

多項(xiàng)研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活在誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化，參與血管形成，抑制細(xì)胞凋亡，以及維持細(xì)胞惡性生物學(xué)特性方面起重要作用［11-14］。本研究顯示，siOCLN組AKT和PI3K蛋白磷酸化水平較control組和siCtrl組明顯降低，提示OCCLUDIN可能激活A(yù)KT/PI3K通路調(diào)控SPC-A1細(xì)胞增殖與凋亡過(guò)程。今后筆者將進(jìn)一步通過(guò)加入信號(hào)通路抑制劑對(duì)研究結(jié)論進(jìn)行反證。

綜上所述，OCCLUDIN可能通過(guò)調(diào)控AKT/PI3K通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌SPC-A1細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。