許子寧 ，李曉紅，葉益超，劉曉銀，3，涂悅△

星形膠質(zhì)細胞（astrocytes，AST）是神經(jīng)組織中最重要的膠質(zhì)細胞，其主要作用是為神經(jīng)元的代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)支持、維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、積極參與神經(jīng)回路構(gòu)成等［1］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損之后，引起一系列急性的反應(yīng)，AST會被激活，從而形成“反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞（reactive astrocytes，RAS）”［2］。RAS的過度增生會形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)元軸突再生，從而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)［3］。不同的損傷類型會誘導(dǎo)不同類型的RAS。已有研究證明，激活的小膠質(zhì)細胞分泌的腫瘤壞死因子（TNF）-α，白細胞介素（IL）-1α和C1q會誘導(dǎo)AST形成神經(jīng)炎癥性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞［4］。Shh（sonic hedgehog，Shh）是成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達的唯一的Hh蛋白質(zhì)，Shh信號通路在經(jīng)典途徑中由其補體受體（Ptch-1）和Smo以及轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白組成，在胚胎神經(jīng)發(fā)育階段起到關(guān)鍵作用［5］。近年來，研究人員利用Shh信號通路參與肝膽管的損傷后修復(fù)［6］，調(diào)節(jié)宮頸癌干細胞的特征［7］，改善椎間盤疾病［8］等。該通路在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對受損的神經(jīng)功能也具有一定的修復(fù)作用。本文通過添加Shh信號通路的激活劑和抑制劑，探討該通路對不同損傷誘導(dǎo)的RAS轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD孕鼠1只，由中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心提供［許可證號SCXK-（軍）2012-0004］，購自斯貝福實驗動物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F 12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（Gibco，美國），小鼠抗Nestin抗體（Abcam，英國），兔抗GFAP抗體（Sigma，美國），兔抗Shh抗體（Proteintech，美國），山羊抗小鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美國），IL-1α（Sigma，I3901）、TNF-α（Cell signaling technology，8902SF），C1q（My bio source，MBS143105），Shh 通 路 激 動 劑（smoothened agonist，SAG）（MCE，HY-12848）、Shh 通路抑制劑環(huán)巴胺（cyclopamine，CYC）（MCE，HY-17024），總RNA提取試劑盒（離心柱型）（天根生化科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），ABI 7300熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司），倒置熒光顯微鏡（Leica DMI4000B）。

1.3 方法

1.3.1 原代AST的提取和鑒定 取1～3 d新生SD大鼠，用75%乙醇浸泡5 min消毒表皮，無菌條件下剪開頭皮與顱骨，暴露大腦，鉗取皮層部分放入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中充分漂洗，隨后放入DMEM/F 12培養(yǎng)基中并于冰上剔除腦膜和血管等組織，將組織轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中并加入0.25%的胰蛋白酶，置于37℃、5%CO2細胞孵箱消化5 min，用培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM/F 12培養(yǎng)基重懸沉淀后置于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h進行差速黏附，吸出懸液。之后使用200目不銹鋼濾網(wǎng)進行研磨過濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM/F 12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞融合度80%～90%，置于恒溫搖床振蕩16 h（37℃、260 r/min），換液繼續(xù)培養(yǎng)并檢測純度，以備后用。

1.3.2 免疫熒光技術(shù)檢測AST純度 細胞計數(shù)板調(diào)整星形膠質(zhì)細胞濃度為1×105/mL后接種于48孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁，4%多聚甲醛固定后，0.5%Triton X-100破膜，5%BSA封閉，使用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（1∶1 000）抗體進行免疫熒光染色，4℃過夜。次日使用山羊抗小鼠IgG二抗37℃孵育1 h，全程避光操作。在熒光顯微鏡下取6個視野，拍照并計算GFAP陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。

1.3.3 實驗分組 實驗分為對照組、炎癥組和劃痕組。對照組細胞為普通星形膠質(zhì)細胞，置于37℃、5%CO2孵箱中正常培養(yǎng)。炎癥組在普通星形膠質(zhì)細胞中加入IL-1α（3μg/L）、TNF-α（30 μg/L）、C1q（400μg/L）。劃痕組細胞是將星形膠質(zhì)細胞以1×104/mL種植于24孔板，用10μL無菌加樣槍頭“井”字劃痕，劃痕間距0.3 mm，注意劃痕時保持勻速和相同力度。劃后換液除去脫落和死亡細胞及碎片，每隔3 d半量換液。

1.3.4 免疫熒光染色法檢測Nestin表達量 炎癥組培養(yǎng)至干預(yù)后24 h，對照組和劃痕組培養(yǎng)至第5天，4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS浸洗3×5 min，使用0.5%Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5%BSA封閉20 min之后加入Nestin（1∶100）抗體，4 ℃過夜。第2天復(fù)溫20 min，PBS浸洗3×5 min，后續(xù)操作避光，加入山羊抗小鼠IgG二抗（1∶200），37℃孵育1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI（1∶100）染核，37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min后熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.5 Western blot檢測Shh蛋白表達量 炎癥組培養(yǎng)至干預(yù)后24 h、劃痕組培養(yǎng)至第5天提取細胞蛋白，將提取出的細胞蛋白與5×上樣緩沖液按體積比4∶1比例制備樣品，放入100℃水浴鍋中加熱煮沸5～7 min進行變性。使用BCA蛋白定量法，繪制蛋白光密度（OD）值的標(biāo)準曲線，計算出各個樣品蛋白濃度。配制10%分離膠（下層）和濃縮膠（上層）后將電泳緩沖液倒入電泳槽中，以80 V電壓進行電泳20 min，后調(diào)制電壓為120 V，直至電泳結(jié)束。進行半干轉(zhuǎn)，脫脂奶粉溶液封閉1 h，孵育一抗Shh（1∶2 000）、過夜，孵育二抗，顯色顯影液A∶顯影液B=1∶1比例配用，顯影并保存圖片。用Image J圖像處理軟件測量條帶灰度值，目的蛋白的相對表達量為目的條帶灰度值與內(nèi)參比值。

1.3.6 Shh信號通路的干預(yù) 3組細胞培養(yǎng)至第7天，更換神經(jīng)干細胞條件培養(yǎng)基（DMEM/F 12、20 mg/L EGF、20 mg/L BFGF、2%B27）后，對上述3組細胞分別添加Shh激活劑（smoothened agonist，SAG，1 μmol/L）和抑制劑（cyclopamine，CYC，3μmol/L），37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d行后續(xù)實驗。

1.3.7 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測各組中神經(jīng)干細胞相關(guān)基因表達水平 將各組細胞按照每皿1.0×105/mL密度接種，培養(yǎng)24 h后待細胞貼壁，提取樣本mRNA，使用羅氏（Rocke）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在熒光定量PCR儀中檢測神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達。內(nèi)參與檢測樣本均設(shè)置3個復(fù)孔，全程冰上操作。qRT-PCR結(jié)果分析保證3復(fù)孔同Ct值相差-0.3～0.3，取復(fù)孔平均值以減少誤差，以β-actin作為內(nèi)參。神經(jīng)干細胞相關(guān)基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s、60℃退火延伸1 min，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用7300 system software分析檢測數(shù)據(jù)。ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）干預(yù)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組，計算2-ΔΔCt值為目的基因的相對表達水平。

Tab.1 The specific primer sequences of neural stem cells表1 神經(jīng)干細胞qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），組間多重比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AST的培養(yǎng)及純度鑒定 提取后的原代星形膠質(zhì)細胞傳至第3代后，細胞核呈圓形或卵圓形，細胞突觸粗短，且分支較多，胞體較小。免疫熒光染色檢測純度為熒光顯微鏡下GFAP陽性細胞數(shù)所占細胞總數(shù)的百分比，結(jié)果顯示純度為94.11%，符合后續(xù)實驗要求，見圖1。

Fig.1 Purity detection of primary astrocytes(×200)圖1 原代星形膠質(zhì)細胞的純度檢測（×200）

2.2 各組細胞中Nestin蛋白的表達量 倒置熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示劃痕組的Nestin表達量明顯高于對照組和炎癥組，見圖2。

Fig.2 The Nestin expression of RAS in each group analyzed by immunofluorescence(immunofluorescence staining,×200)圖2 免疫熒光染色檢測各組RAS的Nestin表達（免疫熒光染色，×200）

2.3 不同損傷類型細胞中Shh蛋白表達量 Western blot結(jié)果顯示，劃痕組Shh蛋白表達量明顯高于炎癥組（0.768±0.341vs.0.094±0.026，n=3，t=3.412，P＜0.05），見圖3。

Fig.3 The shh expressions of RAS in different injured groups analyzed by Western blot assay圖3 Western blot檢測不同損傷組RAS的Shh表達量

2.4 Shh激活劑對不同損傷類型誘導(dǎo)RAS源性神經(jīng)干細胞基因表達的影響 添加Shh信號通路激活劑SAG后的對照組中神經(jīng)干細胞相關(guān)基因表達量較低，炎癥組較對照組有所升高（P＜0.01），劃痕誘導(dǎo)RAS的神經(jīng)干細胞相關(guān)基因表達量較炎癥組和對照組均有明顯增高（P＜0.01），見表2。

2.5 Shh抑制劑對不同損傷類型誘導(dǎo)RAS源性神經(jīng)干細胞基因表達的影響 添加Shh信號通路的抑制劑cyclopamine后3組中神經(jīng)干細胞相關(guān)基因表達量明顯降低，炎癥組較對照組略有升高（P＜0.01），劃痕誘導(dǎo)RAS的表達量較炎癥組和對照組仍有一定增高趨勢（P＜0.01），見表3。

3 討論

3.1 RAS的特點 AST受損后，胞體肥大、周圍突起增多、延展性好、胞漿豐富。這些不同程度的防御性改變統(tǒng)稱為“星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性膠質(zhì)化”。有研究表明，通過對小鼠進行炎癥因子誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥和大腦中動脈閉塞誘導(dǎo)腦缺血缺氧，會產(chǎn)生2種不同的RAS：即A1型RAS和A2型RAS，A1型RAS基本不表達Nestin，且這2種不同的RAS表面基因以及對神經(jīng)系統(tǒng)的作用皆不相同［9］。因此需要研究和利用不同的RAS，以達到修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的目的。本研究通過在AST中添加IL-1α、TNF-α和C1q三種因子作為炎癥RAS模型，以劃痕實驗制備創(chuàng)傷RAS模型，通過免疫熒光染色分析神經(jīng)干細胞的特異性標(biāo)志物Nestin在不同損傷細胞模型中的表達量，發(fā)現(xiàn)炎癥誘導(dǎo)的RAS中Nestin的表達量低于創(chuàng)傷誘導(dǎo)的RAS。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是因為不同的損傷方式對AST活化的程度有影響，導(dǎo)致活化后不同損傷類型的RAS出現(xiàn)差異。所以，探究炎癥誘導(dǎo)的RAS和創(chuàng)傷誘導(dǎo)的RAS到底具有哪些差異可以成為后續(xù)研究的問題。

Tab.2 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with SAG表2 qRT-PCR檢測各組細胞添加SAG后神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達量 （n=3，±s）

Tab.2 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with SAG表2 qRT-PCR檢測各組細胞添加SAG后神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照+SAG組比較，b與炎癥+SAG組比較，P＜0.05

組別對照組對照+SAG組炎癥+SAG組劃痕+SAG組F Nestin 1.000±0 0.421±0.109 2.381±0.153a 5.354±0.845ab 74.065＊＊Pax-6 1.000±0 0.173±0.090 1.462±0.172a 2.654±0.486ab 50.516＊＊Sox-2 1.000±0 0.343±0.122 1.449±0.110a 3.250±0.148ab 397.170＊＊Oct-4 1.000±0 0.244±0.062 1.536±0.256a 2.404±0.310ab 64.308＊＊Map-2 1.000±0 0.156±0.033 1.236±0.252a 3.801±0.639ab 66.731＊＊

Tab.3 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with cyclopamine表3 qRT-PCR檢測各組細胞添加環(huán)巴胺后神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達量 （n=3，±s）

Tab.3 Results of qRT-PCR showing expressions of neural stem cell related genes in each group after treatment with cyclopamine表3 qRT-PCR檢測各組細胞添加環(huán)巴胺后神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達量 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照+CYC組比較，b與炎癥+CYC組比較，P＜0.05

組別對照組對照+CYC組炎癥+CYC組劃痕+CYC組F Nestin 1.000±0 0.029±0.017 0.125±0.026a 0.222±0.031ab 44.290＊＊Pax-6 1.000±0 0.021±0.019 0.101±0.019a 0.176±0.048ab 17.958＊＊Sox-2 1.000±0 0.040±0.024 0.126±0.028a 0.194±0.010ab 36.623＊＊Oct-4 1.000±0 0.029±0.016 0.100±0.021a 0.171±0.034ab 24.590＊＊Map-2 1.000±0 0.013±0.007 0.080±0.021a 0.202±0.010ab 142.947＊＊

3.2 Shh蛋白在不同損傷模型中的表達差異 Shh作為一個重要的調(diào)節(jié)通路，在神經(jīng)系統(tǒng)中有著不可忽視的作用［10］。正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞對Shh分泌較少甚至不分泌。而據(jù)報道，腦創(chuàng)傷等大腦侵襲性損傷相比大腦慢性淀粉樣變性或誘導(dǎo)性神經(jīng)元死亡等非侵襲性損傷導(dǎo)致的腦疾病可引起細胞分泌更多Shh蛋白，從而激活了Shh信號通路，使該通路能夠促進具有神經(jīng)干細胞特性的RAS在體內(nèi)增殖［11］。在本研究中，通過Western blot檢測炎癥組和劃痕組的Shh表達量，發(fā)現(xiàn)劃痕誘導(dǎo)RAS中Shh表達水平明顯高于炎癥誘導(dǎo)的RAS，這一現(xiàn)象即說明Shh的大量釋放是依賴于侵襲性損傷而不是神經(jīng)炎癥等非侵襲性損傷。

3.3 Shh信號通路的激活和抑制 SAG作為Shh信號通路特異性激活劑，是一種苯并噻吩化合物，通過調(diào)節(jié)跨膜蛋白smo與下游效應(yīng)子的結(jié)合來激活通路，對神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元的存活均表現(xiàn)出有益的作用［12］。Cyclopamine是一種甾體生物堿，具有致畸性和抗瘤性，通過其高親和力直接與smoothened結(jié)合來阻斷shh信號通路，從而抑制細胞生長［13］。在本研究中，添加SAG后，創(chuàng)傷誘導(dǎo)的RAS相比炎癥誘導(dǎo)的RAS能表達更多神經(jīng)干細胞的相關(guān)基因，這說明Shh信號通路大量的激活使得創(chuàng)傷性RAS基因組開始轉(zhuǎn)錄和翻譯為神經(jīng)干細胞；而炎癥組較對照組細胞基因的升高是細微的。這種結(jié)果的出現(xiàn)可能是因為創(chuàng)傷性RAS相比炎癥性RAS具有發(fā)展為神經(jīng)干細胞的潛能，Shh信號通路的大量激活使其潛能逐漸被激發(fā)。在添加cyclopamine后，對照組神經(jīng)干細胞的相關(guān)基因表達量極低，但劃痕組表達量明顯較炎癥組仍具優(yōu)勢，這種結(jié)果可能是因為添加抑制劑后細胞培養(yǎng)的時間較長，導(dǎo)致cyclopamine抑制效果逐漸減弱并恢復(fù)了部分Shh信號通路傳導(dǎo)，但創(chuàng)傷誘導(dǎo)RAS較炎癥誘導(dǎo)RAS釋放更多的Shh，因此仍能夠提高部分神經(jīng)干細胞相關(guān)基因的表達。

3.4 Shh信號通路誘導(dǎo)RAS獲得干細胞潛能的優(yōu)缺點 在損傷后具有神經(jīng)干細胞特征的細胞可以為內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)提供重要的新資源，調(diào)節(jié)和控制Shh信號通路來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是一種具有潛力的方法。在發(fā)生腦損傷后，Shh信號通路不僅可以幫助損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞擴散［14］，還可以使受損后RAS啟動內(nèi)源性神經(jīng)保護功能［15］。外源性激活Shh通路亦可促進RAS介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用［16］。該信號通路的神經(jīng)保護作用能夠減少星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)性并維持正常神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境［17］。因此，可以認為Shh信號通路是RAS轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵因素。雖然Shh信號通路具有良好的修復(fù)作用，但其中的某些轉(zhuǎn)錄因子易激活體內(nèi)致癌靶點，加速腫瘤的發(fā)生與增殖［18］。因此，Shh信號通路不當(dāng)?shù)募せ顣铀倌[瘤干細胞的無限增殖，從而引起各種類型癌癥或者加重癌變程度。本研究發(fā)現(xiàn)，單憑Shh信號通路不足以將RAS真正地誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞?？紤]該信號通路具有一定致瘤性，因此在運用時應(yīng)考慮是否通過添加轉(zhuǎn)錄因子等方法提高誘導(dǎo)效率，并控制Shh激活劑或抑制劑的用量來防止其致瘤性。

綜上所述，本研究證明不同類型的RAS對Shh的釋放有差異，而Shh信號通路可以介導(dǎo)損傷后RAS表達神經(jīng)干細胞相關(guān)基因，從而使得其獲得神經(jīng)干細胞潛能。為進一步證明誘導(dǎo)的RAS源性神經(jīng)干細胞是否具有多能性提供了理論依據(jù)。