杜建文，何軍敏，陳春艷，田月珍，徐新明，付雪峰，哈尼克孜·吐拉甫，

趙冰茹1，朱 樺1，黃錫霞1，田可川2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊，830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊，830011)

0 引 言

【研究意義】蘇博美利奴羊是超細(xì)毛美利奴羊新品種，在2014年5月通過了國家農(nóng)業(yè)部的驗收，于我國新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣種羊場培育出[1]。該品種具有抗逆性強、繁殖成活率高、羊毛細(xì)度為17～18 μm、羊毛品質(zhì)好、產(chǎn)毛量高等特點[2]。羊毛受多種基因調(diào)控，其發(fā)育源于皮膚毛囊，是皮膚的衍生物[3]。美利奴細(xì)毛羊皮膚開始形成初級毛囊約在胚胎發(fā)育至50 d；形成初級毛囊約在70 d；第一種次級毛囊開始出現(xiàn)，約在胚胎發(fā)育至85 d；第二種次級毛囊開始形成，約在胚胎發(fā)育至105 d；至羔羊出生時，所有的毛囊都已形成[4-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量毛囊發(fā)育的相關(guān)基因參與了毛發(fā)周期性生長和毛發(fā)形態(tài)發(fā)生的發(fā)育。例如Hox基因、骨形成蛋白、Msx基因、成纖維生長因子、Wnt和Shh等基因，還有大量的激素也一起參與了毛囊生長發(fā)育的調(diào)控[7]。Hox基因是和腫瘤、胚胎發(fā)育以及其他各種疾病的發(fā)生密切相關(guān)的重要因子，與癌癥發(fā)展和細(xì)胞周期控制密切相關(guān)的突出例子是Hox11[8]。Hox基因目前已鑒定的共有39個在哺乳類動物中，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其對毛囊細(xì)胞的分化與增殖有著重要作用[9-11]。在胚胎發(fā)育時期，Hox基因與動物的發(fā)育相關(guān)的頭尾軸和背負(fù)軸的表達(dá)，受到對控基因與間隔基因的調(diào)控，模式表達(dá)為時空共線性[12]。Hox基因中Hoxc13是第一個被證實在控制毛發(fā)的發(fā)育和生長中有著重要作用的基因，當(dāng)它過量表達(dá)或者缺少時，小鼠毛發(fā)生長都會表現(xiàn)出缺陷[13]?！颈狙芯壳腥朦c】近年來對基因的表達(dá)量進(jìn)行了研究，尋找相關(guān)的分子標(biāo)記。研究蘇博美利奴羊不同組織中Hoxc13基因mRNA的表達(dá)量差異?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究Hoxc13基因在蘇博美利奴羊不同組織和皮膚中的定量表達(dá)，建立蘇博美利奴羊皮膚、肌肉以及不同內(nèi)臟組織中GAPDH基因的SYBR Green Ⅱ RT-PCR的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣本

試驗羊群體是來自新疆科創(chuàng)畜牧繁育中心的蘇博美利奴羊，對胎齡分別為65和135 d兩個時期公羔的左側(cè)肩胛部皮膚，右腿大腿后側(cè)肌肉以及不同內(nèi)臟組織(心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)進(jìn)行采集，置于凍存管中，于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)總RNA的提取。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

研究所用的儀器設(shè)備主要有ZHJH-C1112B超凈工作臺、∑H2O摩爾超純水儀、BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機(jī)、Thermo NanoDrop 2000微量分光光度計、BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)、BIO-RAD普通PCR儀、BIO-RAD實時熒光定量PCR儀、LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、METTLER TOIEDO電子天平、DYY-6C型電泳儀、微型離心機(jī)、IKA MS3渦旋振蕩器、Eppendorf移液器等。

表 主要儀器設(shè)備
Table 1 Main equipment

主要儀器供應(yīng)商 ZHJH-C1112B超凈工作臺海爾-20℃冰箱海爾4℃冰箱中科美菱超低溫冷凍儲存箱美的微波爐∑H2O摩爾超純水儀BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機(jī)Thermo NanoDrop 2000微量分光光度計BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD普通PCR儀BIO-RAD實時熒光定量PCR儀LDZM-80KCS-Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌鍋GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱METTLER TOIEDO電子天平DYY-6C型電泳儀DYY-Ⅲ32型電泳槽微型離心機(jī)IKA MS3渦旋振蕩器雪科制冰儀Eppendorf移液器 上海智城分析儀器制造有限公司山東山東山東廣東上海摩勒科學(xué)儀器廠美國Thermo公司美國美國美國美國上海申安醫(yī)療器械廠上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠德國北京六一北京六一杭州奧盛儀器德國江蘇德國eppendorf公司

1.1.3 主要試驗試劑

SYBR Green Ⅱ 熒光染料試劑盒、cDNA合成試劑盒(TaKaRa)、Trizol試劑、MarkerDL2000、Taq酶等，購自上海生工生物公司；硼酸、瓊脂糖、核酸染料、無水乙醇、Tris堿、DEPC、氯仿、四甲基乙二胺(EDTA)、異丙醇等均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.1.4 溶液配置

試劑的配置需要調(diào)節(jié)pH值的試劑在調(diào)節(jié)pH值后，需要進(jìn)行高壓滅菌處理，其滅菌條件為：1.034×105Pa，蒸汽滅菌20 min；在無特殊要求的情況下溶劑均為超純水。以黃培堂[14]的分子克隆實驗指南精編版為試驗中試劑配制的參考。

(1)75%乙醇溶液：將75 mL無水乙醇加入25 mL超純水中，使其充分混勻；

(2)0.5 moL/L EDTA：18.61 g EDTA- Na 2H2O，80 mL水，將pH值調(diào)至8.0并定容至100 mL，高壓滅菌后4℃過夜；

(3)5×TBE：分別加入27 g Tris堿、0.5 M EDTA(pH 8.0)10 mL、13.75 g硼酸于容量瓶中，定容至500 mL；

(4)0.5×TBE：取10 mL 5×TBE溶于90 mL超純水中，充分混勻；

(5)1%瓊脂糖：向100 mL 0.5×TBE中加入1 g瓊脂糖，在微波爐中加熱使其充分溶解；

(6)2%瓊脂糖：向100 mL 0.5×TBE中加入2 g瓊脂糖，在微波爐中加熱使其充分溶解；

(7)0.01%DEPC水：取1 mL DEPC溶于1 000 mL超純水中，將其充分混勻后高壓滅菌，37℃孵化過夜。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因引物設(shè)計

采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0根據(jù)NCBI提供的基因序列進(jìn)行引物設(shè)計，并送至上海生工生物工程有限公司合成所需引物。引物設(shè)計的基本原則為避免引物二聚體以及具有特異性，上下游引物不能相差太大，引物長度在17～25個堿基以內(nèi)，G C含量在40%～60%，避免DNA污染，堿基隨機(jī)分布等。列出試驗引物序列。表2

表2 實時熒光定量PCR引物序列
Table 2 Real-time PCR primer sequences

基因Gene引物序列(5'→3')Primer sequence(5'→3')產(chǎn)物長度(bp)Product length(bp)退火溫度(℃)Annealing temperature(℃)GAPDHF:GAGATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGR:GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTGTTG11358Hoxc13F: GCTGCCGCCTGTCTCACAACR: ACCGACACGTCCAGGTAGCC18762.8

注：F：代表上游引物 R：代表下游引物

1.2.2 蘇博美利奴羊不同組織RNA的提取及檢測

(1)取細(xì)毛羊的皮膚及六種不同組織50～100 mg樣品置于研缽中，分別在液氮中快速研磨成碎末狀；

(2)分別在2 mL離心管中添加1 mL Trizol試劑，再用在液氮中預(yù)冷的小勺將研缽中的組織碎末刮出，并將其加入離心管中渦旋混勻，室溫放置5 min；

(3)將離心管放入低溫離心機(jī)中12 000 r/min，4℃，離心10 min，取新的2 mL離心管向其中加入200 μL氯仿，將離心后的上清液取出移入離心管中，劇烈搖動15 s后室溫放置3 min；

(4)低溫離心機(jī)中12 000 r/min，4℃，離心15 min，另取一新的1.5 mL離心管，將溶有RNA的上層上清液(約500 μL)轉(zhuǎn)移至其中；

(5)添加500 μL(等體積)異丙醇于裝有取出的上清液的離心管中，漩渦混勻，室溫放置30 min；

(6)低溫離心機(jī)中12 000 r/min，4℃，離心10 min，棄上清，在剩下的沉淀物中加入1 mL 75%的乙醇洗滌；

(7)低溫離心機(jī)中8 000 r/min，4℃，離心5 min，去乙醇，將殘留的少量液體瞬時離心后用移液槍小心吸出，室溫放置5 min；

(8)添加適量DEPC水(30～50 μL)，根據(jù)提取出的RNA沉淀量的多少選擇，渦旋混勻，使其充分溶解RNA；

(9)分裝出3 μL提取出的RNA溶液，用于RNA的純度檢測，剩余提取出的RNA溶液于-80℃冰箱中保存；

(10)純度檢測：先用ddH2O將微量分光光度計調(diào)零，再取2 μL RNA提取物測定其純度，檢測要求OD260/OD280的數(shù)值在1.8～2.0。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

(1)將樣本RNA于冰盒上解凍，反轉(zhuǎn)錄試劑盒于室溫解凍；

(2)用微量分光光度計檢測樣本RNA濃度，記錄并計算所需RNA以及RNase-free ddH2O的使用量；

(3)按表3成分于冰盒上配置反應(yīng)步驟一體系混合液1，然后分裝到每個PCR管中，最后加入RNA樣品；表3

(4)將裝有配置好的混合液1的PCR管放入普通PCR儀中42℃ 2 min；

(5)按表4成分于冰盒上配置反應(yīng)步驟二體系混合液2；

(6)取出PCR管，分別向裝有混合液1的PCR管中分裝10 μL混合液2；

表3 反應(yīng)步驟一體系
Table 3 Reaction Step 1: System

試劑Reagent使用量Usage amountgDNA Eraser5X gDNA Eraser BufferRNase-free ddH2ORNA模板1 μL2 μL補至10 μL1 μL

(7)輕柔混勻，放入PCR儀中37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存，反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)管置于-20℃冰箱儲存。表4

表4 反應(yīng)步驟二體系
Table 4 Reaction Step II: System

試劑Reagent使用量Usage amountPrimeScript RT Enzyme MixⅠ5X PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)RT Primer MixRNase-free ddH2O1 μL4 μL1 μL4 μL

1.2.4 熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立

所有提取出的樣品RNA都用內(nèi)參引物GAPDH擴(kuò)增，再分別用相對應(yīng)的Hoxc13基因引物做3個平行樣本進(jìn)行擴(kuò)增，并與內(nèi)參引物擴(kuò)增的片段長度進(jìn)行對比。具體的試驗操作流程按照產(chǎn)品的說明書實施。

(1)配置Real Time反應(yīng)體系。表5

表5 PCR反應(yīng)體系
Table 5 PCR reaction system

組成成分Composition體積VolumecDNA模板SYBR上游引物下游引物RNase-free ddH2O1 μL12.5 μL0.5 μL0.5 μL10.5 μL

(2)在Bio-Rad公司的CFX96實時熒光定量PCR儀上建立反應(yīng)程序。表6

(3)熒光定量PCR產(chǎn)物檢測：取5 μL的熒光定量PCR產(chǎn)物與1 μL的6×Loading buffer充分混勻，在110 V條件下2%瓊脂糖凝膠電泳20 min進(jìn)行檢測，產(chǎn)物片段的大小以DL2000為Marker來標(biāo)記。

表6 熒光定量PCR反應(yīng)程序
Table 6 Fluorescence quantitative PCR reaction procedure

反應(yīng)程序Reaction procedure溫度Temperature時間Time預(yù)變性變性退火延伸(收集熒光)95℃95℃62.8℃95℃30 s5 s30 s5 s 循環(huán)40次

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用軟件SPSS19.0進(jìn)行組間差異顯著性分析，使用Excel軟件對內(nèi)參基因及目的基因的相對表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計分析，每個分析對象都采用3次重復(fù)試驗數(shù)據(jù)的平均值。

相對定量分析2-△△Ct公式：

ΔCt= 目的基因平均Ct-內(nèi)參基因平均Ct

(1)

ΔΔCt=ΔCt(待測樣本)-ΔCt(對照樣本)

(2)

F= 2-△△Ct

(3)

Ct值：每個反應(yīng)熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

圖1Hoxc13基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測
Fig.1Hoxc13 gene detected by agarose gel electrophoresis

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光定量PCR

2.1.1 實時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

用美國Thermo公司的NanoDrop 2000微量分光光度計對從蘇博美利奴羊各組織器官中提取出的RNA進(jìn)行純度檢測，經(jīng)檢測OD260/OD280讀數(shù)在1.8～2.0，說明所提取出的RNA純度高，可以用作后續(xù)的試驗；使用2%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，Hoxc13基因經(jīng)瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果顯示與預(yù)期的擴(kuò)增片段大小一致，無非特異性條帶，可用于后續(xù)的試驗。圖1

2.1.2 熔解曲線

將試驗反應(yīng)體系中目的基因Hoxc13和內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線和熔解曲線進(jìn)行分析，研究表明，擴(kuò)增前期曲線重合性好并且為單一峰，曲線為S型熒光定量動力學(xué)曲線，為理想型擴(kuò)增曲線。熔解曲線分析結(jié)果表明，GAPDH和Hoxc13基因的熔解溫度分別近似為84和81℃；各基因熔解曲線均只有一個特異峰，未出現(xiàn)引物二聚體，說明GAPDH基因及Hoxc13基因的特異性好，PCR反應(yīng)條件得到了較好的優(yōu)化。圖2，圖3

圖2 不同組織GAPDH基因熒光定量PCR擴(kuò)增及熔解曲線
Fig.2 Fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve ofGAPDHgene in different tissues

圖3 不同組織Hoxc13基因熒光定量PCR擴(kuò)增及熔解曲線
Fig.3 Fluorescence quantitative PCR amplification and melting curve of different tissues ofHoxc13 gene

2.2 不同組織不同時期中Hoxc13基因的表達(dá)量

在定量檢測試驗中，內(nèi)參基因是GAPDH，運用SYBR Green Ⅱ染料實時熒光定量PCR的方法來進(jìn)行驗證。試驗采用相對定量法，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因，對蘇博美利奴羊胎齡在65和135 d兩個時期，各三只羊的皮膚和六種不同組織(肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)中，Hoxc13基因mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了分析。圖4

圖4Hoxc13基因在65 d不同組織中的表達(dá)量
Fig.4 Expression of Hoxc13 gene in different tissues at 65 days

2.2.1Hoxc13基因65 d各組織中的表達(dá)量

研究表明，選擇ΔCt值最小的組織(肝臟)為參照。蘇博美利奴羊在胎齡65 d時Hoxc13基因的相對表達(dá)量在各組織器官中差異極顯著，在肝臟中的表達(dá)量極顯著高于在其它各組織和皮膚中的表達(dá)量(P< 0.01)，在皮膚、心臟、腎臟和脾臟中的表達(dá)量顯著高于在肺臟和肌肉組織中的表達(dá)量(P< 0.05)。

2.2.2Hoxc13基因135 d各組織中的表達(dá)量

研究表明，蘇博美利奴羊在胎齡135 d時Hoxc13基因在皮膚和各組織中的相對表達(dá)量有顯著差異，在皮膚中的表達(dá)量顯著高于在肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟組織中的表達(dá)量(P< 0.05)。Hoxc13基因在135 d胎齡的蘇博美利奴羊的各組織器官中均有表達(dá)，并且在皮膚中最高。圖5

圖5Hoxc13基因在135 d不同組織中的表達(dá)量
Fig.5 Expression ofHoxc13 gene in different tissues at 135 days

2.2.3 不同時期中Hoxc13基因的表達(dá)量分析

在胎齡65和135 d這兩個時期，以65 d這一時期作為參照，分析135 d皮膚和各組織中Hoxc13基因的相對表達(dá)量，胎齡在135 d時期較65 d這一期，Hoxc13基因在皮膚中的表達(dá)量顯著高于在肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟組織中的表達(dá)量(P< 0.05)，Hoxc13基因與毛囊發(fā)育密切相關(guān)。圖6

圖6Hoxc13基因在不同時期不同組織中的表達(dá)量
Fig.6 Expression ofHoxc13 gene in different tissues at different times

3 討 論

3.1 RT-PCR分析

RT-PCR技術(shù)是一種對不同樣品間，基因的差異表達(dá)水平進(jìn)行比較及測定的權(quán)威性方法，哈尼克孜·吐拉甫等[15]做了分子遺傳標(biāo)記在綿羊育種中的研究；田月珍等[16]對中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織建立了GAPDH基因RT-PCR方法。內(nèi)參基因選用GAPDH基因，不但對細(xì)微表達(dá)差異的生物學(xué)研究具有重要意義，還有助于校正系統(tǒng)誤差，得到更為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果[17]。試驗的RT-PCR結(jié)果表明，實時熒光定量PCR法可用于蘇博美利奴羊不同組織器官中Hoxc13基因表達(dá)差異的測定。

3.2 Hoxc13基因在不同組織中的表達(dá)

柳楠等[18]在Hox基因家族對細(xì)毛羊羊毛性狀影響的研究中表明，Hoxc13基因與毛囊的生長發(fā)育與分布有關(guān)，其mRNA表達(dá)強度與羊毛長度存在顯著的正相關(guān)，并影響羊毛物理性狀。試驗的實時熒光定量PCR結(jié)果顯示Hoxc13基因在蘇博美利奴羊的皮膚和不同組織(肌肉、心臟、脾臟、肝臟、肺臟、腎臟)中均有表達(dá)，且存在差異性。在胎齡65 d時期，Hoxc13基因的相對表達(dá)量在各組織器官中差異極顯著，在肝臟中的相對表達(dá)量最高，其次是心臟、腎臟、皮膚和脾臟組織，在肺臟和肌肉組織中相對表達(dá)量最低。在胎齡135 d時期，Hoxc13基因在各組織器官中均有表達(dá)，其相對表達(dá)量在皮膚中顯著高于在肌肉及各內(nèi)臟組織中的表達(dá)量，在各組織間的相對表達(dá)量無顯著差異。

3.3 Hoxc13基因在不同時期中的表達(dá)

對比胎齡在65和135 d兩個時期Hoxc13基因在不同組織中的相對表達(dá)量，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在蘇博美利奴羊不同組織和皮膚中均有Hoxc13基因的表達(dá)。毛囊的發(fā)育始于胚胎期皮膚，阿布來提·蘇來曼等[19]對蘇博美利奴羊胎兒皮膚毛囊結(jié)構(gòu)及形態(tài)發(fā)育做了相關(guān)研究，研究結(jié)果表明，蘇博美利奴羊胚胎形成初級毛囊的重要時期是胎齡65～75 d；次級毛囊形成期是胎齡80～85 d；次級毛囊的大量再分化是胎齡105～135 d。試驗結(jié)果表明,Hoxc13基因廣泛表達(dá)于蘇博美利奴羊各組織器官中，并且其相對表達(dá)量在蘇博美利奴羊皮膚中最高，推測該基因在皮膚中的表達(dá)有重要意義，這與Hoxc13基因的表達(dá)水平對毛發(fā)生長和毛囊發(fā)育影響顯著的研究相符[20]。

4 結(jié) 論

Hoxc13基因在蘇博美利奴羊各組織器官中均有表達(dá)且存在表達(dá)差異；并且在皮膚中Hoxc13基因的表達(dá)量高于在肌肉、腎臟、心臟、脾臟、肺臟和肝臟組織，Hoxc13基因可能與毛囊發(fā)育的過程密切相關(guān)。