朱博文 陳立妹 郭竹玲,2

1.海南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 ?？?570100；

2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科 ?？?570100

牙周病是發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎性疾病。全球范圍大數(shù)據(jù)統(tǒng)計得出，20%的成年人可由牙周炎導(dǎo)致的骨缺損不可逆地走上失牙之路[1]。牙周病的病程進展被認為是由內(nèi)源性革蘭氏陰性菌感染引發(fā)和維持的炎癥性宿主反應(yīng)的結(jié)果。

炎性小體（inflammasome）是一組蛋白質(zhì)復(fù)合物，是宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵參與者。其在機體中能夠識別包括病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）的多種誘導(dǎo)刺激，是細胞內(nèi)重要的先天免疫傳感器；當(dāng)先天性免疫防御受損時，活化的受體同樣可以參與適應(yīng)性免疫防御[2-4]。NLRP3炎性小體是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域亞成員，是炎性小體眾多家族成員中研究最廣泛、深入的一個，已被證實在牙周病的發(fā)生、發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。

1 NLRP3炎性小體

自2002年Martinon首次提出炎性小體的概念，世界各地的研究者便對炎性小體展開各方面的研究，并將其與宿主防御以及各類疾病聯(lián)系起來。

Bostanci等[5]證實，NLRP3炎性小體表達水平顯著增高與牙周疾病關(guān)系密切。到目前為止，已經(jīng)在人體22種不同的核苷酸結(jié)合寡聚域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體（NOD-like receptor）/核苷酸結(jié)合域與含富亮氨酸重復(fù)序列受體（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat-containing receptor，NLR）家族蛋白質(zhì)分子以及熱蛋白結(jié)構(gòu)域（Pyrin domain，PYD）的NLRP中鑒定出14種亞家族成員（NLRP1～NLRP14）[6-8]。

NLRP3炎性小體是由3種組分組成的，即NLRP3、細胞凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspaserecruitment domain，ASC）以及半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，caspase）-1組成。

NLRP3包括3個特征性結(jié)構(gòu)域，即C端富亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR)、中央NACHT（NAIP、CIITA、HET-E和TP1）以及N端PYD。ASC由其N端的PYD和C端的caspase活化募集結(jié)構(gòu)域（caspase-activating and recruitment domain，CARD）組成[3-4,9]。NLRP3可通過PYD結(jié)合含PYD-CARD的接頭蛋白ASC，并以CARD結(jié)構(gòu)域募集并觸發(fā)caspase-1激活，從而促進白細胞介素前體（pro-interleukin，pro-IL）-1β和pro-IL-18成熟，分泌白細胞介素（interleukin，IL）-1β與IL-18[4]（圖1）。IL-1β與IL-18是牙周病發(fā)生、發(fā)展過程中重要的促進因子。

圖 1 NLRP3炎性小體的組成和組裝Fig 1 Composition and assembly of NLRP3 inf l ammasome

2 NLRP3炎性小體在牙周疾病中的信號傳導(dǎo)機制

NLRP3炎性小體與炎癥性牙周疾病聯(lián)系緊密[5]，NLRP3炎性小體可以引發(fā)牙齦上皮細胞早期宿主免疫應(yīng)答。慢性牙周炎與廣泛型侵襲性牙周炎患者牙周組織中NLRP3的表達顯著高于健康組織[10]，Isaza-Guzmán等[11]的研究也顯示，唾液中NLRP3、ASC和IL-1β水平與慢性牙周炎和廣泛型侵襲性牙周炎關(guān)系密切。

通常有2個信號參與NLRP3炎性小體活化（圖2）：1）信號一為微生物刺激或內(nèi)源性細胞因子，如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等被Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）或NLR識別，并以腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、核因子（nuclear factor，NF）-κB等炎性因子依賴性方式誘導(dǎo)NLRP3表達的上調(diào)，同時促進pro-IL-1β、pro-IL-18的產(chǎn)生[4,12]；2）信號二來自不同種類的NLRP3炎性小體激活劑，數(shù)量繁雜，主要包括外源性微生物刺激、內(nèi)源性危險信號以及無機晶體結(jié)構(gòu)3類[13]。一旦激活，這些復(fù)合物將促進caspase-1活化，以及NLRP3炎性小體寡聚化，并將pro-IL-1β和pro-IL-18裁剪成具有活性的IL-1β和IL-18[4,9,12]。

圖 2 NLRP3炎性小體的信號傳導(dǎo)模型Fig 2 Signaling models of NLRP3 inf l ammasome

在人巨噬細胞中，牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）可以通過阻斷Fn介導(dǎo)caspase-1激活及IL-1β的分泌。Taxman等[14]認為第二信號是研究NLRP3炎性小體受牙周微生物抑制的新思路。目前有3種模型得到普遍認同：離子流動模型、活性氧（reactive oxygen species，ROS）模型以及溶酶體破裂模型[4,7,13]（圖2）。這3種模型并不是相互獨立與排斥，而是互相呼應(yīng)與補充。Shimada等[15]提出3種模型將匯集同一途徑來誘導(dǎo)釋放氧化的線粒體DNA，以激活NLRP3炎性小體的統(tǒng)一理論。

2.1 離子流動模型

在離子流動模型中，K+等離子水平的變化在NLRP3炎性小體激活中起關(guān)鍵作用，如細胞外三磷酸腺苷（extracellular adenosine triphosphate，eATP）激活離子通道P2X7并觸發(fā)快速K+流出，對NLRP3具有活化作用[4]。正如Almeida-da-Silva等[16]所回顧，已證實牙周疾病中P2X7和P2X4受體對于炎性小體NLRP3的激活作用，牙齦上皮細胞表面P2X7受體可作為組裝NLRP3炎性小體的第二個信號，不僅對eATP誘導(dǎo)的IL-1β分泌至關(guān)重要，而且對細胞內(nèi)pro-IL-1β處理也很重要。研究[17-19]證實，K+流出是牙齦卟啉單胞菌介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活所必需的。P2X7受體所介導(dǎo)的第二信號傳導(dǎo)同樣也是NLRP3炎性小體受抑制的作用點。Morandini等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌的菌毛能夠通過干擾嘌呤受體P2X7的ATP信號傳導(dǎo)，來減少P2X7活化所介導(dǎo)的pro-IL-1β加工，在第二信號水平抑制IL-1β。

2.2 ROS模型

ROS形式的氧化應(yīng)激廣泛地涉及NLRP3炎性小體活化，所有炎性小體NLRP3刺激物都將引發(fā)ROS的產(chǎn)生[4,7]。在牙齦上皮細胞中，發(fā)現(xiàn)ATP通過由P2X4/P2X7/pannexin-1組成的復(fù)合物誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而生成的ROS能夠激活NLRP3炎性小體和caspase-1[19,21]；在P2X7受體傳導(dǎo)ATP刺激的過程中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶和線粒體會協(xié)同生成線粒體ROS（mitochondrial ROS，mROS）[22]，而抑制NADPH氧化酶也降低了ATP誘導(dǎo)的mROS產(chǎn)生[19]。如果ROS生成的途徑被阻斷，NLRP3炎性小體也會受到抑制。Choi等[22]發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌效應(yīng)物核苷二磷酸激酶（nucleosidediphosphate kinase，NDK）可以阻斷牙齦上皮細胞中eATP刺激P2X7受體并由NADPH氧化酶活化介導(dǎo)產(chǎn)生ROS氧化應(yīng)激傳導(dǎo)鏈的過程，并抑制ATP介導(dǎo)的炎性小體活化過程中caspase-1激活及IL-1β的分泌[23]。使用NDK同源物也可抑制eATP刺激引發(fā)的先天性免疫反應(yīng)[23]。

2.3 溶酶體破裂模型

溶酶體破裂模型是針對晶體或大顆粒結(jié)構(gòu)激活劑（如尿酸晶體、明礬、二氧化硅、瘧疾瘧原蟲、羥磷灰石等）時所提出的。吞噬細胞吞噬這些激活劑導(dǎo)致溶酶體損傷，NLRP3炎性小體能夠感知外漏的溶酶體內(nèi)容物[4,7]。Montenegro Raudales等[24]發(fā)現(xiàn)未燒制的牙結(jié)石激活的NLRP3炎性小體依賴于吞噬作用，并且牙結(jié)石的晶體結(jié)構(gòu)刺激NLRP3炎性小體的活化并且部分地促進人和小鼠吞噬細胞中的IL-1β分泌。該模型進一步提出了組織蛋白酶B是NLRP3炎性小體所感知的介質(zhì)[4,7]。Park等[18]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B的抑制顯著降低牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的細胞毒性和ASC胞吞體形成的程度，也會降低了牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)的caspase-1活化和IL-1β生成。牙齦卟啉單胞菌能在一定程度上影響細胞的運輸，并通過逃避通向溶酶體的內(nèi)吞途徑來抑制NLRP3炎性小體。Taxman等[14]認為這種抑制效果是牙齦卟啉單胞菌調(diào)節(jié)核心細胞骨架蛋白的結(jié)果，而通過抑制內(nèi)吞作用可鑒定抑制炎性小體的牙齦卟啉單胞菌成分，這有利于牙周炎病因的探索與治療的開發(fā)。

3 NLRP3基因多態(tài)性在牙周疾病中的免疫調(diào)控

在牙周疾病中，不僅NLRP3炎性小體可以引發(fā)牙齦上皮細胞早期宿主免疫應(yīng)答，巨噬細胞同樣也可被NLRP3炎性小體所激活[25]。牙齦卟啉單胞菌可抑制巨噬細胞內(nèi)單鈉尿酸鹽、肽聚糖和明礬誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化，但卻不抑制ATP和尼日利亞菌素誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體活化[14]。而這種NLRP3炎性小體的抑制與活化現(xiàn)象在牙周疾病中并不單一。以慢性牙周炎中最常見的病原體牙齦卟啉單胞菌為例，其LPS刺激牙齦上皮細胞上調(diào)IL-1β表達和促進細胞內(nèi)IL-1β積累[26]，與eATP刺激一并被認為是NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵[27]。但在某些狀態(tài)下，牙齦卟啉單胞菌也可抑制NLRP3炎性小體活化。在牙齦卟啉單胞菌感染的人髓樣單核細胞系Mono-Mac-6細胞中，牙齦卟啉單胞菌通過下調(diào)NLRP2和ASC表達來減少NALP3炎性復(fù)合體的表達[5]，而在牙齦上皮細胞中，牙齦卟啉單胞菌感染可直接下調(diào)牙齦上皮細胞中NLRP3的表達，但對ASC的表達無顯著影響[26]。報道[28]表明即使NLRP3的表達升高，牙齦卟啉單胞菌可直接誘導(dǎo)NLRP3的蛋白質(zhì)水解。

在復(fù)雜的口腔生態(tài)環(huán)境、多種細菌共生的條件下，多數(shù)學(xué)者支持齦上生物膜可增加牙齦纖維細胞中caspase-1、ASC、AIM2、IL-1β和IL-18的表達，但不影響NLRP3表達。齦下生物膜在較低濃度下增強caspase-1、ASC、AIM2、IL-1β和IL-18表達，在較高濃度下將其下調(diào)，均可對NLRP3表達產(chǎn)生顯著影響[29-30]。牙周病原體影響NLRP3炎性小體活化與抑制這2種截然不同狀態(tài)，被認為是其操控宿主先天免疫反應(yīng)的途徑。通過活化NLRP3炎性小體分泌IL-1β與IL-18，可顯著增加牙槽骨損失，破壞牙周組織形成適合牙周病原體繁殖的環(huán)境[31]；當(dāng)宿主對細菌免疫反應(yīng)過強時，可通過抑制NLRP3炎性小體降低宿主的反應(yīng)強度，便于細菌繁衍與入侵[14]。

另有研究[29,32]表明，牙齦卟啉單胞菌具有協(xié)同感染功能，可策略性干擾多種炎癥組分的表達，實現(xiàn)操縱先天性免疫反應(yīng)的目的，進而維系牙周組織中相關(guān)微生物物種的存活和持久性。

牙周病原體影響NLRP3炎性小體的活化與抑制，可能與NLRP3基因多態(tài)性與基因突變有關(guān)。目前的免疫遺傳學(xué)研究[33-34]表明，牙周病發(fā)病機制具有個體差異，而宿主遺傳因素是影響個體易感性重要的因素。NLRP3是細胞內(nèi)“危險信號”的傳感器，NLRP3基因多態(tài)性可致NLRP3炎性小體過度活化。不同個體面對外源性感染會引發(fā)成慢性炎癥反應(yīng)[35]。

臨床中也常見即使有大量牙菌斑、牙石形成但仍然保持牙周健康的患者；也有牙周生物膜積累較少但極易患牙周疾病的個體[33-34]。Isaza-Guzmán等[36]的研究表明，NLRP3（rs4612666）CT/CC基因型的單核苷酸多態(tài)性與衰老和/或吸煙的協(xié)同相互作用在牙周病的致病途徑中起重要作用；還發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體突變可導(dǎo)致人類遺傳性炎性疾病的發(fā)生。cryopyrin相關(guān)周期熱綜合征是一種常見的自身免疫性疾病，以皮疹、關(guān)節(jié)痛和長時間的發(fā)熱為特征，NLRP3突變導(dǎo)致caspase-1活化增強和自發(fā)性IL-1β和IL-18分泌增加，而IL-1抑制劑可有效地控制病情進展。NLRP3在常染色體隱性遺傳性疾病掌跖角化-牙周破壞綜合征發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[37]，并與克羅恩病、銀屑病幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、白塞綜合征和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的若干炎癥性疾病易感性顯著相關(guān)[36]。NLRP3（第705位谷胱酰胺）和CARD8（第10位半胱苷酸）的變異被認為可能是常見慢性炎癥性疾病的重要因素[35,38]，NLRP3的功能獲得性突變可導(dǎo)致NLRP3組成性活化，導(dǎo)致IL-1R依賴性的IL-1β過表達[35]。IL-1β單核苷酸多態(tài)性也與牙周病存在相關(guān)性。

4 展望

目前，對于NLRP3在牙周疾病中活化與抑制的現(xiàn)象已得到確認，就其發(fā)生機制已提出部分假說。確切的機制以及各假說之間的關(guān)系尚未明確。多種復(fù)雜牙周微生物對NLRP3炎性小體的綜合調(diào)節(jié)作用還存在諸多空白。對于NLRP3炎性小體基因多態(tài)性與基因突變在牙周疾病中的研究也剛剛起步。探索NLRP3炎性小體的多重功能，有助于為臨床治療牙周病與相關(guān)慢性炎性疾病提供新思路；了解NLRP3炎性小體基因與牙周疾病易感性的關(guān)系有利于牙周疾病易感人群的確定與牙周疾病的預(yù)防。明確抑制NLRP3炎性小體的機制有利于對慢性炎性疾病治療方法的研發(fā)。