李春麗，梁仲城，蘭貴斌，梁林慧

(廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 533000)

過量的鋁會(huì)危害人體健康，誘發(fā)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的病變[1]，但鋁及其化合物能否引起生殖系統(tǒng)的損害仍存有爭議[2]。廣西是我國主要鋁產(chǎn)地之一，明確及評估過量鋁是否引起人體生殖系統(tǒng)的危害是本地區(qū)公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的問題。早老素相關(guān)菱形(presenilin associated rhomboid like，PARL)蛋白是組成線粒體膜菱形蛋白成分之一，在保持線粒體形態(tài)、調(diào)控線粒體功能中具有重要作用[3]。目前有研究提示精子形成及獲能中，PARL蛋白起到重要作用[4]。本研究旨在探討鋁暴露工人精子線粒體PARL蛋白水平與精子功能的相關(guān)性，以及線粒體PARL蛋白水平下調(diào)的分子機(jī)制。從而為防治鋁生殖毒害提供全新視角。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取廣西某大型鋁企業(yè)鋁作業(yè)男性工人162名，作業(yè)工種為熔煉工(64名)、焊接工(42名)及電解工(56名)，設(shè)為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)連續(xù)3年及以上時(shí)間從事鋁作業(yè)；(2)未接觸引起精子質(zhì)量受損的有害環(huán)境因素，如多環(huán)芳烴、錳、汞、鉛、高溫等；(3)在標(biāo)本采集前2周內(nèi)未服用任何影響生殖系統(tǒng)功能或精子質(zhì)量的藥物；(4)依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有如冠心病、糖尿病、高血壓等慢性疾病及惡性腫瘤；(2)曾罹患如生殖器官受損、甲狀腺炎等影響精子質(zhì)量的疾?。?3)酗酒、吸煙，年齡超過60歲。選取162名該企業(yè)下屬非直接從事鋁暴露作業(yè)的服務(wù)公司男性工人，作業(yè)工種為電工(66名)、鉗工(45名)和鍋爐工(51名)，設(shè)為對照組。兩組研究對象在年齡、工齡、飲酒、吸煙及文化程度等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。研究過程遵循知情同意原則，并通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2標(biāo)本采集

1.2.1血液與尿液 抽取及收集各研究對象靜脈血5 mL及尿液6 mL，靜脈血分別注入干燥管和乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管中。EDTA-K2抗凝管充分混勻后，置4 ℃冰箱短時(shí)(<7 d)保存，用于PARL基因C44055G多態(tài)性檢測；干燥管靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清置-20 ℃冷凍保存，尿液加入6 mol/L適量鹽酸預(yù)貯存，置于-20 ℃低溫冰箱中保存，用于測定血清及尿液中鋁元素。

1.2.2精液 研究對象禁欲3～7 d后，采用手淫法采集精液標(biāo)本，置于無菌容器中，用于精子常規(guī)檢測、精子線粒體PARL蛋白的水平測定。精液標(biāo)本的保存及處理參照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與實(shí)驗(yàn)室手冊(第5版)[5]。

1.2.3作業(yè)環(huán)境鋁元素檢測 在電解、配料及鑄造3個(gè)鋁作業(yè)車間及對照組工作環(huán)境，各布置15個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集3個(gè)標(biāo)本。采樣嚴(yán)格按照《工作場所空氣中有害物質(zhì)監(jiān)測的采樣規(guī)范(GBZl59-2004)》的要求，使用醋酸纖維濾膜定點(diǎn)連續(xù)采集空氣中鋁塵標(biāo)本。

1.3儀器與試劑 AAS Zeenit 600石墨爐原子吸收光譜儀(德國耶拿儀器公司)、安捷倫GCMS高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)、Lab-aid820致善核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)、ABI-9700核酸擴(kuò)增儀(美國ABI公司)、超微量紫外分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像儀(珠海黑馬公司)；線粒體PARL檢測試劑(臺(tái)灣Abnova公司)、DNA 抽提試劑(廈門致善生物科技有限公司)、引物(上海生工公司)、PCR擴(kuò)增試劑(大連TaKaRa公司)。

1.4方法

1.4.1血清和尿液中鋁水平測定 血清及尿液中鋁水平的測定采用高效液相色譜法檢測，實(shí)驗(yàn)具體操作參照參考文獻(xiàn)[6]。

1.4.2作業(yè)環(huán)境鋁水平檢測 石墨爐原子吸收光譜法測定作業(yè)環(huán)境鋁水平，實(shí)驗(yàn)詳細(xì)操作參照美國國立職業(yè)安全與健康研究所(NIOSH)推薦的環(huán)境鋁水平測定。

1.4.3精液常規(guī)分析 精液常規(guī)檢測由專業(yè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員完成。主要檢測指標(biāo)為外觀、精液量、液化時(shí)間、pH值、黏稠度指拉絲、精子存活率、凝集、精子密度和圓細(xì)胞。

1.4.4精子線粒體PARL蛋白水平檢測 精子線粒體PARL蛋白水平測定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測，試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.4.5PARL基因C44055G多態(tài)性檢測

1.4.5.1DNA制備 全血DNA的制備采用致善全自動(dòng)核酸提取儀提取，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，提好的DNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 兩組研究對象一般資料比較

1.4.5.2C44055G檢測 引物：根據(jù)GenBank提供的PARL基因啟動(dòng)子序列，用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列 5′-TGAAGTCGCTGAAATGATAGG-3′，下游引物序列5′-ACAGTAGGGTGAAGGGTAT-3′。PCR反應(yīng)體系：PCR混合反應(yīng)液8 μL(含d NTP、buffer)，Taq酶1 μL，無菌水37 μL，DNA模版2 μL和上、下游引物各1 μL，共50 μL反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性；在較高退火溫度漸降循環(huán)8次：94 ℃ 30 s，從67 ℃至60 ℃每次漸降1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4.5.3基因位點(diǎn)-限制性片段長度多態(tài)性分析 酶切體系：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL，buffer 3 μL，BstNI內(nèi)切酶1 μL，無菌水6 μL，共30 μL反應(yīng)體系。置37 ℃水浴1 h。PCR產(chǎn)物為545 bp(C等位基因)，酶切后為377 bp 和168 bp 的兩個(gè)片段(G等位基因)。水浴后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(2.0%)電泳驗(yàn)證(100 V電壓,電泳30 min)，凝膠圖像分析儀觀察電泳結(jié)果并保存。

1.5問卷調(diào)查 通過自行設(shè)計(jì)的問卷對研究對象進(jìn)行社會(huì)經(jīng)濟(jì)狀況、營養(yǎng)狀況、工作崗位及年限、吸煙、飲酒情況、既往疾病等進(jìn)行調(diào)查，同時(shí)結(jié)合企業(yè)每年的體檢資料，獲取職業(yè)性鋁暴露史及既往疾病史或服藥狀況等。

2 結(jié) 果

2.1兩組作業(yè)環(huán)境鋁、血清鉛、尿液鋁水平的檢測結(jié)果 與對照組比較，試驗(yàn)組的作業(yè)環(huán)境鋁、血清鉛及尿液鋁水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清鋁水平與尿液鋁水平呈正相關(guān)(r=0.841,P=0.018)；作業(yè)工齡與尿鋁、血清鋁水平均呈正相關(guān)(r尿鋁=0.525,P=0.021；r血清鋁=0.621,P=0.016)；尿鋁、血清鋁水平與作業(yè)環(huán)境鋁水平的相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r尿鋁=0.238,P=0.069；r血清鋁=0.261,P=0.056)。

2.2兩組受試對象精液常規(guī)及精子線粒體PARL蛋白水平檢測結(jié)果比較 與對照組比較，試驗(yàn)組精子存活率、精子活力及線粒體PARL蛋白水平均明顯降低，精子畸形率卻顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組間其余精液指標(biāo)雖有差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，精子線粒體PARL蛋白水平與精子活力、精子存活率呈正相關(guān)(r精子活力=0.713,P=0.012；r精子存活率=0.628,P=0.008)；而精子畸形率與精子線粒體PARL蛋白水平表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(r精子畸形率=0.953,P=0.002)。

表2 兩組作業(yè)環(huán)境鋁、血清、尿液鋁水平測定結(jié)果比較

表3 兩組精液常規(guī)檢測結(jié)果及線粒體PARL蛋白水平比較

續(xù)表3 兩組精液常規(guī)檢測結(jié)果及線粒體PARL蛋白水平比較

2.3兩組研究對象PARL基因C44055G多態(tài)性檢測結(jié)果比較 經(jīng)H-W平衡檢驗(yàn)，兩組的PARL基因C44055G差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合H-W 群體遺傳平衡法則，具有群體代表性。試驗(yàn)組的CG及GG基因型的分布頻率高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同基因型間精子線粒體PARL水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果表明，GG基因型PARL水平顯著低于CG 和CC型(P<0.05)，CG型、CC型之間的男性PARL水平差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖1。

表4 兩組PARL基因C44055G檢測結(jié)果[n(%)]

表5 PARL基因不同基因型精子線粒體PARL蛋白水平

a：P<0.05，與GG基因型比較；b：P<0.05，與CG基因型比較

1～2：GG基因型；3～4：CG基因型；5～7：CC基因型

圖1PARL基因C44055G電泳圖

3 討 論

隨著鋁礦的開采、煉鋁，鋁制品的加工、使用及食品添加劑的廣泛應(yīng)用，過量的鋁通過呼吸道、消化道等多種途徑進(jìn)入人體。進(jìn)入人體的鋁元素以AI(H2O)3+的形式與血液中的清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白或枸櫞酸離子結(jié)合，并隨血液分布與腦、肺、肝、腎、骨等組織中。因此過去認(rèn)為血液和尿液鋁濃度可以作為反映鋁暴露水平的監(jiān)測指標(biāo)。但部分研究認(rèn)為血清鋁水平并不能敏感地反映鋁暴露情況[7-8]。本研究結(jié)果表明，廣西某大型鋁企業(yè)的鋁作業(yè)工人主要通過呼吸道攝入過量的鋁，進(jìn)而引起機(jī)體血清鋁和尿液鋁水平顯著升高，且血清鋁、尿液鋁之間呈正相關(guān)，這與GUPTA等[7]認(rèn)為血鋁不能真實(shí)地反映鋁暴露情況的結(jié)論相悖。進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血清鋁、尿液鋁水平均與鋁作業(yè)工齡呈正相關(guān)，提示鋁暴露不僅引起鋁作業(yè)工人血清鋁和尿液鋁的水平升高，而且隨著鋁暴露時(shí)間的增加，鋁可在體內(nèi)蓄積，進(jìn)而引起血清鋁和尿液鋁的水平顯著升高；同時(shí)，這一結(jié)果也提示從事鋁暴露作業(yè)工作應(yīng)適當(dāng)調(diào)整、控制鋁暴露時(shí)間或限制工作的年限，以減輕鋁暴露對作業(yè)工人的損害。

有研究表明，高濃度鋁可能是影響精子生成及數(shù)量的高危環(huán)境因素[9]。ZHU等[10]發(fā)現(xiàn)給予120 d鋁暴露后的大鼠精子數(shù)量、質(zhì)量顯著降低。而HADI等[11]以18 mg/kg的高劑量氧化鋁飼養(yǎng)雄性大鼠30 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠精子數(shù)量、精子活力及畸形精子率明顯改變，但精子功能損傷并不嚴(yán)重，提示鋁暴露時(shí)間對動(dòng)物生殖功能的影響至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，較對照組，試驗(yàn)組的精子活力、精子存活率明顯下降，畸形率顯著增高。兩組在精液量、pH、黏稠度指拉絲、液化時(shí)間、凝集、精子密度和圓細(xì)胞等差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分析原因可能是：鋁所引起的生殖毒性，受鋁暴露途徑、水平、時(shí)間、頻率、年齡、個(gè)體差異等諸多因素的影響，因此國內(nèi)外研究結(jié)論存在明顯的差別[12]。

諸多研究表明鋁暴露能夠誘發(fā)精子功能損害，但其具體的毒性作用機(jī)制仍不清楚。PARL蛋白是位于線粒體內(nèi)膜上的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)蛋白， 參與了線粒體的形態(tài)改變、線粒體融合及線粒體通路的細(xì)胞凋亡等過程。有研究認(rèn)為精子線粒體上的PARL蛋白是精子生成的關(guān)鍵性調(diào)控蛋白，同時(shí)也是精子線粒體獲能及能量補(bǔ)給的主要因子[13]。人的PARL基因位于人類染色體3q27，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成。有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)7號(hào)外顯子44055位點(diǎn)的C/G突變(C44055G)，導(dǎo)致PARL第262位的亮氨酸被纈氨酸替換(Leu262Val替換)，這替換進(jìn)而影響PARL蛋白第4跨膜區(qū)保守氨基酸的改變，從而導(dǎo)致了PARL分泌減少或活性降低。進(jìn)而導(dǎo)致線粒體數(shù)量、形態(tài)和功能的改變，從而引起機(jī)體生理功能的改變[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，鋁暴露工人的精子線粒體PARL蛋白水平明顯降低，且與精子活力、存活率、精子畸形率相關(guān),說明過量鋁可能引起PARL蛋白水平的降低，進(jìn)而導(dǎo)致精子供能系統(tǒng)失衡，誘發(fā)精子活力下降，同時(shí)啟動(dòng)精子細(xì)胞凋亡，繼而精子存活率降低等不良結(jié)局[15]。在本研究中，鋁暴露作業(yè)工人PARL基因CG及GG基因型的分布頻率明顯高于對照組，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但分析原因可能是：(1)PARL基因Leu262Val替換不是導(dǎo)致廣西鋁暴露工人精子線粒體PARL水平低下的原因。這與HADI等[11]研究PARL蛋白基因Leu262Val多態(tài)性與2型糖尿病的結(jié)論相一致，但與CURRAN等[14]認(rèn)為高加索人PARL基因Leu262Val替換嚴(yán)重影響線粒體的數(shù)量及結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致線粒體供能不足進(jìn)而細(xì)胞凋亡的結(jié)論不一致(研究對象的種族不同，基因遺傳規(guī)律存在差異)；(2)PARL基因C44055G多態(tài)性可能是廣西鋁暴露工人精子質(zhì)量下降危險(xiǎn)因素，但引起精子質(zhì)量的影響因素有環(huán)境、遺傳、生活習(xí)性等諸多因素，可能本研究納入研究對象選取上具有局限性，不足以檢測出相關(guān)性。PARL基因C44055G不同基因型男性精子線粒體PARL水平有顯著差異間接驗(yàn)證了這一結(jié)論。

綜上所述，鋁暴露降低鋁作業(yè)工人精子活力和存活率，增加精子畸形率，而且這些改變與PARL蛋白水平密切相關(guān)。然而，鋁致生殖毒作用損傷的機(jī)制及PARL基因C44055G多態(tài)性是否是下調(diào)精子線粒體PARL蛋白的作用機(jī)制目前仍尚未明確，需后續(xù)深入研究加以論證。