汪少華,李 丹,黃叢改,王潔瓊,萬 宇,昝 瀟,楊 波,楊志惠△

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院：1.病理科；2.腫瘤科,四川瀘州 646000)

胸腔積液是許多疾病常見的臨床體征，許多惡性胸腔積液(MPE)疾病早期發(fā)現和治療能顯著提高患者的生存率[1]。胸腔積液的細胞學檢查目前被認為是獲得診斷的首選和主要途徑[2]。然而細胞學是一種高度依賴形態(tài)學的檢查方法，需要經過嚴格培訓和經驗豐富的病理醫(yī)生及高質量的制片技術。若病理醫(yī)生診斷經驗不足，或因長期閱片造成的視力疲勞等均會造成假陽性及假陰性[3-4]。 DNA定量分析技術(DNA-ICM)是一種建立在基因水平上新興的全自動檢查方法[5]。本研究旨在研究薄層液基細胞學(TCT)聯(lián)合DNA-ICM技術來鑒別MPE，減少診斷過程中的人為誤差，探討MPE最佳的檢測方法，為臨床診斷和評估MPE提供依據,現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年7月至2018年6月在西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院住院的678例胸腔積液患者為試驗組，其中男372例，女306例，年齡16～91歲。269例MPE患者，其中男152例，女117例，年齡16～91歲，轉移性腺癌208例，轉移性鱗癌30例，大細胞癌7例，小細胞癌12例，間皮瘤6例，淋巴瘤4例，未分型2例。409例良性胸腔積液標本作為對照組，所有研究對象均經臨床和病理診斷證實。每例患者胸腔積液標本均采用TCT和DNT-ICM檢查。本研究所有研究對象均知情同意，并經過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1制片及染色 取100 mL胸腔積液標本,離心機在室溫下，以1 500 r/min 離心15 min，取沉淀進行復懸，應用新柏氏液基細胞保存，采用膜式薄層液基細胞學制片機(美國豪洛捷醫(yī)療技術公司)制片，每例制成2張薄層細胞學片，1張薄層細胞片行HE染色進行TCT檢查，1張行 Feulgen DNA染色，全自動細胞 DNA圖像定量分析系統(tǒng) (廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司) 作DNA定量分析。

1.2.2TCT診斷 由病理科有豐富細胞學診斷經驗的職稱為中級及以上醫(yī)師完成TCT閱片及診斷，查找惡性腫瘤細胞。TCT診斷結果分4級，Ⅰ級：未查見惡性腫瘤細胞；Ⅱ級：查見異型細胞；Ⅲ級：查見可疑惡性腫瘤細胞；Ⅳ級：查見惡性腫瘤細胞(包括轉移性癌和惡性間皮瘤等)。參照文獻[6]以Ⅰ級定為陰性判斷標準，Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級定為陽性。

1.2.3DNA-ICM診斷 由全自動細胞圖像掃描分析系統(tǒng)對每例5 000個以上胸腔積液細胞核進行自動聚焦掃描處理[7]。該系統(tǒng)同時測定每個細胞核DNA的132個參數特征，自動對被檢細胞進行分類和計數，自動打印DNA倍體分析直方圖和細胞點陣分布圖，主要通過測定染色體細胞核積分光密度(IOD)值來判斷細胞核DNA的含量，并以二倍體細胞(G1/G0)DNA指數(DNA index，DI) 為1，正常細胞 DI 值多為1左右；當DI為2時，多為四倍體細胞(G2/M期)。DI為1.1～1.9和2.1～2.9的細胞被認為是異倍體細胞。當異倍體細胞DI在1.1～1.9形成峰值，或有3個以上的細胞DI≥2.5時，可作為DNA-ICM診斷MPE的陽性指征。通常將DNA-ICM診斷結果分為3級，Ⅰ級：正常標準，無明顯異倍體細胞峰及異倍體細胞；Ⅱ級：可疑惡性標準，查見少量DNA倍體異常細胞 (1～2 個細胞，DI≥2.5)；Ⅲ級：惡性標準，查見大量DNA倍體異常細胞 (3個或 3個以上細胞，DI≥2.5) 及異倍體細胞峰。 其中DI≥2.5以上的標本玻片需經有經驗的細胞病理學醫(yī)生在顯微鏡下閱片，以防系統(tǒng)將深染雜質和擁擠重疊的細胞核誤認為惡性細胞造成假陽性。 在統(tǒng)計學分析時將Ⅰ級定為陰性胸腔積液，Ⅱ級和Ⅲ級定為陽性胸腔積液。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數資料以率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TCT和DNA-ICM診斷結果比較 在TCT診斷結果為炎性胸腔積液、異型細胞、可疑惡性及惡性腫瘤對應的DNA倍體陽性率分別為7.2%、37.0%、47.6%、55.4%，見表1。

表1 TCT檢查和DNA-ICM分析比較(n)

2.2TCT、DNA-ICM與臨床病理結果比較 經臨床和病理證實的269例MPE，TCT診斷為Ⅱ～Ⅳ級者214例，DNA-ICM發(fā)現少量異倍體細胞及以上152例。409例對照組胸腔積液標本中，TCT檢測有62例假陽性，而DNA-ICM檢測只有20例出現假陽性，見表2、圖1～2。

2.3TCT與DNA-ICM診斷靈敏度及特異度的比較 TCT在MPE診斷中的總體靈敏度為79.6%，DNA-ICM的總體靈敏度為56.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。TCT和DNA-ICM在MPE診斷中的特異度分別為84.8%、95.1%，DNA-ICM特異度雖然高于TCT，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4TCT或DNA-ICM與聯(lián)合診斷的比較 TCT單獨診斷靈敏度遠高于DNA-ICM，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步比較，29例患者在TCT診斷良性積液，而DNA-ICM分析中出現DNA倍體異常細胞，TCT與DNA-ICM聯(lián)合診斷靈敏度為90.0%，特異度為89.5%,聯(lián)合診斷的特異度雖有所降低，但是靈敏度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 TCT和DNA-ICM在MPE中檢測中的靈敏度和特異度分析(n)

A：DNA指數直方圖及散點圖；B：細胞核圖像及DI值；C：Feulgen DNA染色細胞形態(tài)(×200)

圖1惡性胸腔積液標本DNA倍體檢測

A：DNA指數直方圖及散點圖；B：細胞核圖像及DI值；C：Feulgen DNA染色細胞形態(tài)(×200)

圖2良性胸腔積液標本中DNA倍體檢測

3 討 論

臨床上有胸腔積液的病例很多，為患者抽胸腔積液除了可減輕癥狀外，也可從細胞病理角度明確胸腔積液的性質。判斷是惡性腫瘤還是其他非腫瘤性疾病引起的胸腔積液，是細胞病理學診斷的難點[6,8]。MPE的診斷方法有很多種，包括胸腔積液脫落細胞學檢查、DNA倍體定量分析、影像學檢查、腫瘤標志物檢查、胸腔積液分子標記、胸腔鏡活檢等。其中，胸腔鏡活檢組織病理學是最準確的檢查方法，被稱為金標準[9-10]。細胞病理學檢查是診斷胸腔積液最常用的經典檢查方法，尤其是對于不能耐受胸腔鏡等有創(chuàng)檢查的患者。但是細胞學檢查的靈敏度變化與細胞病理醫(yī)生的經驗、送檢標本的質量，腫瘤的分型和分化程度有關。

DNA倍體定量分析是腫瘤早期檢測中的重要一環(huán)，通過DNA倍體分析進行胸腔積液良惡性的診斷在國內外已有大量文獻報道，在北美、歐洲已是常規(guī)臨床檢測方法之一[11-12]。細胞DNA定量分析目前大多數是采用流式細胞儀(FCM)或計算機圖像分析儀(ICM)，但FCM的設備昂貴，必須制備單細胞懸液，操作更復雜，不適合基層醫(yī)院開展。DNA-ICM分析通過全自動數碼顯微鏡掃描標本玻片的每一個視野，全自動檢測細胞內DNA的含量變化來判定細胞是否發(fā)生癌變，采用自主分析系統(tǒng)并使用具體數據作為描述腫瘤生物學和形態(tài)學的特點，可發(fā)現先于形態(tài)學改變的惡性細胞[13-14]。因此測定其細胞DNA含量可以作為臨床診斷MPE的客觀依據之一。

本研究發(fā)現，TCT檢查的靈敏度高于DNA-ICM分析，但特異度低于DNA-ICM分析。TCT在MPE診斷中的靈敏度為79.6%、特異度為 84.8%，DNA-ICM分別為 56.5%、95.1%，靈敏度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。雖然相比TCT，DNA-ICM可以提供很多更客觀的診斷信息，但是本研究發(fā)現DNA-ICM也有假陽性和假陰性，推測DNA-ICM出現假陽性的原因可能是少數炎性胸腔積液中的細胞可出現退變或核固縮，這些細胞在Feulgen染色時，可出現DI≥2.5的異倍體細胞。這時需要反復檢查，并且結合TCT結果和免疫組織化學結果以鑒別炎性或MPE。DNA-ICM出現假陰性的原因主要是對成團的癌細胞不能識別，MPE中以轉移性腺癌最為常見，腺癌細胞常聚集成團，DNA-ICM有時不能識別而造漏診。

進一步研究分析發(fā)現如果TCT與DNA-ICM分析聯(lián)合診斷，靈敏度可提高為 90.0%，特異度變?yōu)?9.5%。實驗表明，與單獨TCT或DNA-ICM分析相比較，聯(lián)合診斷可明顯提高靈敏度，胸腔積液陽性檢出率明顯增多，但是特異度與單獨DNA倍體分析有所降低。這一結果與在宮頸的研究報道一致[4,15]。另外，在對照組的良性胸腔積液中，TCT診斷11例異型細胞，18例可疑惡性腫瘤，33例惡性腫瘤，而DNA-ICM結果只有20例假陽性。而且在TCT診斷的402例炎性胸腔積液中DNA-ICM發(fā)現了29例陽性標本。這是因為細胞學診斷主要依賴細胞形態(tài)結構特點，TCT制片技術雖然成熟，但是因為胸腔積液不僅成分復雜，更重要的是正常間皮細胞在炎癥等各種刺激因素的作用下可出現增生，甚至非典型增生，這些增生與的間皮與轉移性癌，特別是高分化癌細胞在鏡下，從形態(tài)學上細胞病理學醫(yī)師很難鑒別。DNA-ICM通過檢測細胞DNA含量變化來判定細胞是否發(fā)生癌變，不會受細胞形態(tài)改變的影響，因此聯(lián)合診斷有利于MPE的早期準確診斷。

綜上所述，DNA-ICM在胸腔積液的診斷中有效彌補了TCT診斷可能引起的漏診和誤診。TCT聯(lián)合DNA-ICM較單純TCT或DNA-ICM在胸腔積液診斷方面具有更好的靈敏度和較高的特異度，可以減少TCT診斷中細胞病理醫(yī)師的人為因素和DNA-ICM固有缺陷造成的漏診和誤診，進一步保證胸腔積液診斷工作的質量，有較大的臨床應用價值。