周海燕,薛雨順,王新川,高寧寧

1.陜西省人民醫(yī)院眼科(西安 710068);2.空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院(西安 710032)

大量的研究已證實蛋氨酸(Methionine,Met) 對維持晶狀體透明度是非常重要的，它是抗氧化物谷胱甘肽的前體[1-2]。甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Betaine-homocysteinemethy transferase，BHMT)是Met循環(huán)中重要的酶，它利用同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和提供甲基的甜菜堿(Betaine，Bet)催化 Met 的再合成[3-4]。在胎兒晶狀體文庫中，BHMT 是一個大量表達的基因[5]。前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)標記的蛋白質(zhì)組學技術研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì),首次報道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標本進行了驗證[6]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。本研究將構建穩(wěn)定過表達BHMT的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染人晶狀體上皮細胞，為進一步研究其在白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用提供生物學基礎。

材料與方法

1 主要試劑及儀器 人晶狀體上皮細胞(Human lens epithelial cells,HLEC)由本實驗室保存,慢病毒GV358載體、AgeI / AgeI 酶切，購自上海吉凱基因化學技術有限公司。1kp DNA ladder Marker(Fermentas公司),瓊脂糖(賽百盛公司),250 bp DNA ladder Marker與Primer(捷瑞生物公司)。In-FusionTMPCR Cloning Kit (Clontech公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化,Taq polymerase(SinoBio公司),限制性內(nèi)切酶(NEB公司)。dNTP(Takara公司), PCR儀(Applied Biosystems), DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)購自 Gibco 公司，引物由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

2 細胞培養(yǎng) HLEC培養(yǎng)于含體積分數(shù)15% 胎牛血清的低糖 DMEM 7培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2的恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

3 研究方法

3.1 引物設計和合成：從Gen Bank 資料庫中獲得人 BHMT 的 mRNA 序列(NM-001713),基因引物設計為：上游 5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCCACCCGTTGGGGGCAAAAAG- 3′；下游：5′- TCCTTGTAGTCCATACCCTGTGATTTGAATTTTTGTTTTTC - 3′。聚合酶鏈反應擴增 BHMT 基因片段。

3.2 BHMT-GV358 過表達質(zhì)粒載體構建：用 Age I 酶對純化的 GV358 質(zhì)粒 DNA 進行酶切，對載體酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，獲得線性化的 GV358 載體。將RT-PCR擴增純化的BHMT基因片段與酶切后 GV358 質(zhì)粒 DNA連接得到重組載體GHMT-GV358，行 PCR 鑒定，鑒定的陽性克隆轉(zhuǎn)化子測序,測序結(jié)果和目的基因序列比對分析。將正確的菌液轉(zhuǎn)接到10 ml 含相應抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，進行質(zhì)粒抽提。

3.3 慢病毒包裝及滴度測定：將該慢病毒包裝系統(tǒng)中的3種質(zhì)粒(BHMT-GV358 20 μg，pHelper 1.0載體 15 μg，pHelper 2.0 載體 10 μg)與轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫下孵育15 min，將復合物加入293T細胞培養(yǎng)液中孵育養(yǎng)，于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)6～8 h, 棄去原培養(yǎng)基，換上10 %含 FBS 的 DMEM 10 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集含有病毒顆粒的細胞上清。將取得的病毒上清液于25 000 r/min，4 ℃條件下離心2 h，收集沉淀，加入適量病毒保存液，重懸，高速離心5 min 后，取上清，分裝并保存至-80 ℃冰箱。進行慢病毒滴度測定。

3.4 BHMT基因表達檢測：對數(shù)生長期的293T細胞接種到24孔板中(細胞數(shù)約為 2×104)，37℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)細胞融合度達到約80%。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，4～6 h 后觀察細胞狀態(tài)，更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h 后觀察質(zhì)粒熒光標記基因表達情況，判斷轉(zhuǎn)染效率，熒光率大于80%，熒光拍完后補加500 μl正常培養(yǎng)基，待長滿后收集細胞用于RNA提取或蛋白質(zhì)檢測。①RT- PCR檢測BHMT mRNA的表達。實驗分組：陰性對照組(NC組)、BHMT過表達組(OE組)用于擴增基因的引物序列上游：5'- CCACTTTGACCCCACCATTA- 3'，下游：5'- GCTAGCTCATTTGTCGTCATC- 3'；以 GAPDH 基因為內(nèi)參照基因，用 2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。mRNA 相對表達量=2-ΔΔCt，ΔCt=目的基因 Ct 值-內(nèi)參基因 Ct 值，-ΔΔCt=對照組 ΔCt 平均值-各樣品ΔCt 值。②Western blot 法檢測BHMT基因表達。各組細胞裂解后超聲破碎細胞，取上清 BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，經(jīng) SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉 2 h之后于 4 ℃ 冰箱內(nèi)與一抗孵育過夜，室溫漂洗后給予二抗孵育1 h，再次漂洗后加入配置好的顯色液，用ECL法結(jié)合X光片顯色。

3.5 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞:人晶狀體上皮細胞分為兩組，感染組,(LV-BHMT24172-1)病毒感染，對照組,陰性對照病毒CON220感染，分別接種于 6 孔板，細胞密度為20%，感染條件為Eni.S+polybrene，以感染復數(shù)(MOI)= 10 計算病毒量，感染后 16 h更換感染液,72 h于熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，熒光率要達到70%～80%左右，細胞匯合度達80%左右后進入下一步實驗。

結(jié) 果

1 成功構建BHMT-GV358 載體 PCR 擴增目的基因并行凝膠電泳，見目的條帶出現(xiàn)于1262 bp 處(圖 1)。構建 BHMT-GV358 重組載體后，進行 PCR 鑒定，顯示在第5～12泳道出現(xiàn)目的條帶(圖 2)，陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為655 kb，進行測序及比對驗證，經(jīng) GenBank 中BHMT序列對比驗證，序列完全一致，表明已成功構建重組質(zhì)粒(圖 3)。

2 轉(zhuǎn)染后細胞熒光觀察及滴度測定 將BHMT-GV358 病毒包裝后感染 293T細胞，熒光顯微鏡見熒光表達結(jié)果較強(圖4)。細胞內(nèi)觀察到明顯熒光，說明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常，熒光標記基因表達正常，表示 BHMT蛋白可以在 293T細胞中表達。根據(jù)計算公式qPCR 滴度(TU/ml)=N×C/V，計算平均滴度。經(jīng)滴度檢測，病毒滴度約為2.00E+08TU/ml。

3 RT-PCR 檢測 BHMT基因表達情況 見表1。將病毒濃縮液加入293T細胞培養(yǎng)基，獲得穩(wěn)定感染的293T細胞。轉(zhuǎn)染后提取細胞內(nèi)總 RNA，利用RT-PCR 法檢測BHMT mRNA 的表達水平，所得結(jié)果與GAPDH的結(jié)果相比較。在本實驗中過表達組BHMT基因表達豐度明顯升高，是對照組的986.181倍(圖5)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 BHMT基因在各組的表達豐度

注：與過表達組與對照組相比, *P<0.05

圖1 BHMT基因片段的PCR擴增

1:陰性對照(ddH2O); 2:陰性對照(空載體);3:陽性對照(GAPDH);4:Marker：5、3、2 、1.5、1 kb，750、500、250、100 bp；5～12：轉(zhuǎn)化子

圖2 BHMT-GV358載體的酶切鑒定

圖3 克隆序列測序圖

圖4 BHMT-GV358載體轉(zhuǎn)染293T細胞(熒光視野與明視野對照圖)(100×, 200×)

圖5 轉(zhuǎn)染后各組 BHMT mRNA 相對表達量 (P<0.05)

4 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞 熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染后的過表達細胞系可見GFP表達，感染效率在90%左右(圖6)

圖6 慢病毒感染人晶狀體上皮細胞

5 Western blot 方法檢測 BHMT蛋白表達情況 感染重組慢病毒BHMT 48 h 后收集重組慢病毒感染和對照未感染的293T細胞，檢測BHMT蛋白表達,Western blot檢測可以觀察到47 kD附近處有特征條帶，大小與目的基因融合蛋白吻合。提示此質(zhì)粒用FLAG抗體檢測到BHMT，可在 293T細胞內(nèi)正常表達，且在感染組中明顯高于對照組(圖 7)。

圖7 Western blot檢測轉(zhuǎn)染組(OE)與對照組(NC)BHMT蛋白表達

討 論

前期我們利用基于同位素相對和絕對定量(iTRAQ)標記的蛋白質(zhì)組學技術研究分析了不同年齡人白內(nèi)障晶狀體核與透明晶狀體核間的差異蛋白質(zhì), 并首次報道了BHMT在高齡組白內(nèi)障晶狀體核區(qū)的水平較年輕組明顯下調(diào)，進一步通過新的臨床白內(nèi)障晶狀體標本進行了驗證[6]。但其在晶狀體老化和白內(nèi)障形成中如何參與代謝等確切機制尚不清楚。Rao 等[7]第一次在恒河猴的晶狀體核中發(fā)現(xiàn)了BHMT，其表達約占核部總蛋白的 0.5%～10%，但具體機制不清。人源 BHMT的研究表明，BHMT 是含 Zn2+的金屬酶，相對分子量為 45×103,由 406 個氨基酸組成[8]。Met 或谷胱甘肽與白內(nèi)障的發(fā)生密切相關[9-10]。BHMT 是 Met 循環(huán)中重要的酶, 是Hcy代謝過程中重要的酶類，在對高Hcy血癥的研究中發(fā)現(xiàn)，BHMT 表達與生物學活性降低是高 Hcy 血癥發(fā)生的分子基礎, 它可以調(diào)控 Hcy 的水平。BHMT 是 Hcy 重新甲基化生成 Met 的關鍵酶，是機體在生理狀況下維持 Hcy穩(wěn)定代謝水平的重要功能蛋白質(zhì)。高 Hcy 除了與心血管疾病、神經(jīng)性疾病、糖尿病等全身疾病相關外[11-12]，與白內(nèi)障等眼部疾病的發(fā)生發(fā)展密切[13-17]。研究發(fā)現(xiàn)在相同的誘導條件下BHMT 轉(zhuǎn)基因小鼠的高 Hcy 血癥發(fā)病率明顯低于對照組，并可保護肝臟細胞免受高Hcy濃度的損傷[18]。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)兩種miRNAs 通過分化靶向海刺參中 BHMT 來直接影響體腔細胞中Hcy 含量，靶基因BHMT siRNA 或補充Hcy均可明顯促進體腔細胞 ROS 的產(chǎn)生，表明靶基因BHMT通過調(diào)控Hcy的含量發(fā)揮生物學功能。更值得關注的是, BHMT 不僅對已生成的 Hcy 具有高效直接的轉(zhuǎn)化功能，且由于與細胞膜有很好的親和性，外源性 BHMT 能被吸收入細胞發(fā)揮生物學功能。因此，調(diào)控或直接補充 BHMT 已經(jīng)成為高Hcy 血癥治療研究的一個新的重要熱點。

慢病毒(Lentivirus)載體是基于人類免疫缺陷型病毒(HIV)發(fā)展起來的基因治療載體，它對分裂細胞和非分裂細胞都具有感染力，能在體內(nèi)較長期表達且安全性高。慢病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒[20]，目前已廣泛應用在以基因為靶點的各種基礎實驗研究中。通過慢病毒載體系統(tǒng)，我們能有效地將目的基因整合入宿主細胞基因組中，從而得到可以穩(wěn)定表達目的基因的細胞株，是研究基因及其表達產(chǎn)物功能的有力工具。我們首次在人老年性白內(nèi)障晶狀體核中篩選鑒定出了BHMT 的表達降低，非常有必要明確其表達的變化與老化和白內(nèi)障形成的機制。本實驗成功構建并包裝了重組 BHMT-GV358慢病毒載體，成功轉(zhuǎn)染293T細胞，采用RT-PCR 在mRNA 水平檢測到BHMT表達明顯增加，說明BHMT BHMT-GV358能夠有效介導BHMT的過表達，并用構建成功的BHMT基因過表達的慢病毒載體在體外有效感染了人晶狀體上皮細胞，為進一步研究BHMT在 白內(nèi)障及與Hcy有關的疾病發(fā)病機制中的作用打下了良好的實驗基礎。