李永男 車守梅 張 祁 杜仁峰 王洪財 郭朝暉 赫丹丹

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是最常見的慢性疼痛之一，多種病因如外傷、感染及糖尿病等均可導(dǎo)致其發(fā)病[1，2]。由于其發(fā)生率高、病理機制復(fù)雜、臨床治療效果欠佳，已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一大難題。既往研究者對于NP的研究主要圍繞在脊髓及其下位水平，發(fā)現(xiàn)初級感覺神經(jīng)元的敏化及脊髓背角突觸可塑性改變是NP發(fā)病的重要機制[3，4]。然而，疼痛作為一種復(fù)雜的體驗，除了感覺成分外，還包括認知及情感成分，而認知及情緒調(diào)節(jié)則是腦的功能屬性[5]。因此，對于NP發(fā)生、發(fā)展過程中腦區(qū)特殊部位的研究已成為探索NP發(fā)病機制的新方向。已有研究表明海馬在疼痛感覺分辨、痛情緒調(diào)節(jié)等神經(jīng)信息處理過程中扮演重要角色[6～8]。

近年來，神經(jīng)-免疫反應(yīng)在NP發(fā)病中的重要作用已得到研究者的廣泛認可，而小膠質(zhì)細胞的激活在其中起到關(guān)鍵作用[1～4,9]。激活的小膠質(zhì)細胞釋放炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，而這些促炎性因子對NP的發(fā)生、發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞抑制劑米諾環(huán)素在多種NP動物模型中都觀察到具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并抑制上述促炎性細胞因子的釋放[1,10]。但是，這些研究均圍繞在脊髓水平，而米諾環(huán)素是否同樣在海馬水平抑制小膠質(zhì)細胞的激活、調(diào)控促炎性細胞因子的釋放還不清楚。因此，本研究通過觀察米諾環(huán)素對L5脊神經(jīng)結(jié)扎橫斷所致NP模型大鼠的行為學(xué)改變以及海馬水平TNF-α、IL-1β、IL-6表達變化的影響，探討米諾環(huán)素在海馬參與NP調(diào)控的可能機制。

材料與方法

1.材料:(1)實驗動物：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量220～260g。由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。實驗期間大鼠分籠飼養(yǎng)，自然光照，自由攝水和食物1周。所有實驗操作符合我國《實驗動物管理條例》。(2)儀器和試劑：Touch Test Sensory Evaluator (EXACTA)，高速低溫離心機(美國Sigma公司)，酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，熒光定量PCR儀(瑞士ABI公司)，手術(shù)器械(上海金鐘手術(shù)器械)，384孔RT-PCR板(美國ABI公司)，RT-PCR反應(yīng)膜(美國ABI公司)，PrimeScriptTMRT master mix (Perfect real time，日本TaKaRa公司)，TRIzol(日本TaKaRa公司)，Power SYBR Green PCR Master(美國Thermo公司)，無水乙醇(國藥集團，10009218)，注射用青霉素鈉(華北制藥公司，F(xiàn)5082102)，米諾環(huán)素(源葉生物公司，S17015-5g)。

2.模型制備：按照完全隨機法將大鼠36只分成4組，每組9只，正常組(Z組)、假手術(shù)組(J組)、模型+生理鹽水組(MS組)及模型+米諾環(huán)素組(MM組)。采用大鼠左側(cè)L5神經(jīng)結(jié)扎橫斷(L5spinal nerve transection, L5-SNT)術(shù)制備大鼠NP模型[11]。MS及MM組大鼠腹腔注射3%水合氯醛(10ml/kg)麻醉后，將大鼠俯臥位固定在鼠板上，皮膚消毒后在L4～S1水平沿脊椎中線作縱行切口，逐層分離左側(cè)椎旁肌肉組織，暴露L6橫突后用咬骨鉗咬除L6橫突，在靠近L5背根神經(jīng)節(jié)處結(jié)扎神經(jīng)，并在遠端切斷，創(chuàng)面撒青霉素干粉后依次縫合肌肉和皮膚。J組僅暴露L5神經(jīng)而不予以結(jié)扎及橫斷。MM組于SNT神經(jīng)病理性疼痛模型建立后每天給予米諾環(huán)素40mg/kg腹腔注射，而MS組給予同等劑量的生理鹽水(均在每次動物行為學(xué)測定前15h給藥)。

3.觀測指標(biāo):(1)行為學(xué)檢測：采用up-and-down方法[12]，分別于術(shù)前1天，術(shù)后1、2、3、7和11 天測定大鼠50%機械刺激縮足閾值 (paw withdrawal threshold,PWT)。測定前將大鼠置于金屬網(wǎng)為底的透明有機玻璃箱內(nèi)30min，使之逐漸安靜并適應(yīng)實驗環(huán)境。選用0.2、0.4、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0g不同刻度的Von Frey絲對大鼠左后肢足底部進行機械性刺激，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為則為陽性反應(yīng)，記錄標(biāo)度。以2g作為初始強度，若陰性，則更換相鄰大一級刻度，若陽性，則更換相鄰較小刻度，如此反復(fù)，記錄以第1個陽性反應(yīng)前一點為起點的6個連續(xù)數(shù)值，計算大鼠50% PWT。(2)海馬促炎性細胞因子水平測定：大鼠行為學(xué)測定結(jié)果表明Z組及J組大鼠機械痛閾在不同時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，將J組作為陰性對照組，測定機械性痛閾后，選擇術(shù)后不同時間點2、7、11天，隨機取J組、MS組及MM組大鼠并處死(每組每個時間點3只)，立即剝離大腦，分離海馬組織迅速置于-80℃液氮中保存。按照Trizol法提取海馬組織總RNA，取總RNA 0.5μg 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：95.0℃ 3min；95.0℃ 10s；60.0℃ 30s，共進行40個循環(huán)，3種細胞因子測定條件相同。反應(yīng)在熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行。檢測結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，然后依據(jù)2-△△CT法進行相對定量分析[13]?；蛞锛耙镄蛄幸姳?。

表1 PCR引物及序列

結(jié) 果

1.行為學(xué)檢測：術(shù)前1天4組大鼠痛閾值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1天，MS組及MM組大鼠表現(xiàn)出術(shù)側(cè)足趾并攏、背屈、輕度外翻且常處于懸空位，無自殘及跛行表現(xiàn)。MS組大鼠術(shù)后第2、3、7及11天行為同術(shù)后1天相似，而MM組大鼠逐漸趨于正常。Z組及J組大鼠一般狀態(tài)及行為表現(xiàn)較前無明顯變化。與術(shù)前1天比較，MS組大鼠術(shù)后術(shù)側(cè)PWT迅速降低(P<0.01)，與Z組及J組比較，MS組大鼠手術(shù)側(cè)50% PWT明顯下降(P<0.01)。與術(shù)前1天比較，MM組大鼠術(shù)后手術(shù)側(cè)PWT亦明顯下降(P<0.01)，除術(shù)后第3天外，其余各時間點大鼠PWT明顯低于Z組及J組(P<0.05)。MM組大鼠術(shù)后第3、7、11天術(shù)側(cè)PWT較MS組大鼠明顯增高(P<0.05)。Z組與J組的50%PWT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1。

2.海馬促炎性細胞因子水平測定:大鼠行為學(xué)測定結(jié)果表明Z組及J組大鼠機械痛閾在不同時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，將J組作為陰性對照組。

圖1 米諾環(huán)素對L5-SNT大鼠機械痛閾的影響MS組大鼠PWT與術(shù)前1天、Z級及J組比較，*P<0.01；MM組大鼠PWT與Z組及J組比較，#P<0.05;MM組大鼠PWT與MS組比較，ΔP<0.05

與J組比較，MS組大鼠海馬TNF-α于術(shù)后第2天開始增高，第7天達高峰，至術(shù)后11天仍保持較高水平(P<0.05)，與MS組比較，MM組TNF-α水平在術(shù)后2、7、11天表達均下降，其中以第7天最為顯著(P<0.05，圖2A)。與J組比較，MS組大鼠海馬IL-1β在術(shù)后第11天表達明顯上調(diào)(P<0.05)，而與MS組比較，MM組大鼠IL-1β表達均下調(diào)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(圖2B)。與J組比較，MS組大鼠海馬IL-6含量在術(shù)后第2天表達增高(P<0.05)，并且在術(shù)后第7天、11天仍處于較高水平，應(yīng)用米諾環(huán)素后，其含量在術(shù)后第2、7、11天表達均下調(diào)(圖2C)。

圖2 米諾環(huán)素對L5-SNT大鼠海馬水平TNF-α、IL-1β、IL-6表達變化的影響A.TNF-α;B.IL-1β;C.IL-6。與J組比較，*P<0.05;與MS組比較，#P<0.05

討 論

疼痛是一種復(fù)雜、多維的體驗，除感覺成分外，情緒及認知亦是其重要組成部分。臨床上，NP患者常常伴有記憶能力減退，并且有超過50%的患者伴有抑郁、焦慮樣負性情緒，但目前由于對于痛性腦機制的認知不足，使得新型鎮(zhèn)痛藥的開發(fā)和個體化治療方式的研究陷入瓶頸。近來已有研究報道，海馬是疼痛等傷害性信息加工及修飾的關(guān)鍵腦區(qū)，但具體機制尚未闡明[6～8]。

以往的大量研究證實，膠質(zhì)細胞所介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)在NP發(fā)生和維持中扮演重要角色[1,3,4,9]。此過程中，小膠質(zhì)細胞的形態(tài)、增殖能力、基因表達和功能迅速發(fā)生變化，并通過神經(jīng)遞質(zhì)受體的表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活以及大量炎性介質(zhì)的釋放與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞以及其他免疫系統(tǒng)細胞相互交流，成為NP發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)。米諾環(huán)素是一種半合成四環(huán)素類抗生素，除了其高效、廣譜的抗菌作用外，還具有抗炎、抗細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護等多種作用，并且在多種NP動物模型中都觀察到米諾環(huán)素的應(yīng)用具有較好的鎮(zhèn)痛效果[1,14]。目前，多數(shù)研究者認為其鎮(zhèn)痛機制主要與其抑制NP過程中小膠質(zhì)細胞的激活、調(diào)節(jié)突觸間傳遞、減少促炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-6的表達和釋放有關(guān)[1,10,14，15]。但上述研究主要圍繞脊髓及其下位水平，而對于NP發(fā)病過程中在海馬水平是否同樣伴有小膠質(zhì)細胞的激活以及促炎性細胞因子的釋放還不十分清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用米諾環(huán)素后，L5-SNT神經(jīng)病理性疼痛大鼠的機械性異常疼痛明顯改善。與此同時，通過RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，SNT大鼠海馬水平TNF-α、IL-1β、IL-6都有不同程度的表達上調(diào)，而腹腔內(nèi)注射米諾環(huán)素后，上述促炎性細胞因子的表達及釋放均有不同程度的降低。

TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)功能的促炎性細胞因子，在NP的神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮著重要作用。近來，在多種NP動物模型中都觀察到脊髓背角TNF-α及其受體水平表達增加，而應(yīng)用TNF-α抑制劑干預(yù)后，實驗動物脊髓背角TNF-α及其受體水平明顯下降并且疼痛得到明顯緩解[16，17]。在臨床方面，脊髓損傷(SCI)且伴有NP的受試者與對照組比較，外周血清TNF-α水平增加約70%[18]。對于海馬水平，Martuscello等[19]發(fā)現(xiàn)大鼠海馬水平TNF的表達上調(diào)可導(dǎo)致實驗大鼠出現(xiàn)持續(xù)的疼痛癥狀，而抑制其在海馬水平的表達后，大鼠NP的相關(guān)行為亦明顯改善[20]。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組大鼠海馬TNF-α于術(shù)后第2天開始增高，在第7天達高峰，并且術(shù)后11天仍保持較高水平。應(yīng)用米諾環(huán)素后SNT大鼠海馬TNF-α的表達明顯下調(diào)，其中以術(shù)后第7天下調(diào)最為顯著。既往的研究表明，TNF-α可通過提高神經(jīng)元的興奮性、調(diào)節(jié)突觸的可塑性、激活疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及激活更多免疫細胞等參與NP的產(chǎn)生及維持[3，4,9]。由此，研究推測TNF-α是海馬參與疼痛調(diào)控的關(guān)鍵因子，而降低海馬TNF-α表達是米諾環(huán)素的重要作用機制之一。

IL-1β是IL-1家族的成員之一，廣泛地參與NP過程中細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)及疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在NP的調(diào)控中亦扮演重要角色。Pilat等[21]在慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷(CCI)所致NP大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，CCI術(shù)后大鼠出現(xiàn)異常性疼痛和痛覺過敏且伴隨脊髓IL-1β mRNA水平的顯著上調(diào)，而鞘內(nèi)注射IL-1受體拮抗劑后大鼠的痛覺過敏得到緩解。在海馬水平，Del等[22]發(fā)現(xiàn)CCI對Wistar Kyoto(WKY)大鼠觸覺閾值無明顯影響，海馬內(nèi)IL-1β表達亦無明顯變化，而坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)可導(dǎo)致WKY大鼠出現(xiàn)超敏反應(yīng)且伴有手術(shù)對側(cè)海馬IL-1β mRNA水平顯著升高。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)海馬IL-1β水平在術(shù)后第11天表達明顯上調(diào)，但在SNT術(shù)后早期及11天后并無明顯變化，這與Del等[22]研究報道具有一定的一致性。出現(xiàn)上述不同結(jié)果的原因可能與疼痛模型和大鼠品系的差異相關(guān)。應(yīng)用米諾環(huán)素后在不同時間點IL-1β的表達均降低，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明米諾環(huán)素對海馬IL-1β的表達有一定的影響，但其并不是米諾環(huán)素的主要作用機制。

IL-6是一種多效能細胞因子，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的分化、再生及神經(jīng)保護方面起著重要作用。近來研究表明，IL-6也參與對傷害性感受的加工和病理性疼痛的調(diào)節(jié)。Brázda 等[23]在CCI所致NP大鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠L4～L5以及C7～C8水平背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)IL-6及IL-6受體(IL-6R)mRNA水平均較假手術(shù)組明顯增加。在腦區(qū)紅核(RN)參與NP調(diào)控的研究中，Ding等[24]研究發(fā)現(xiàn)，SNI大鼠手術(shù)對側(cè)RN內(nèi)IL-6和IL-6R水平在術(shù)后第3周顯著增加，而術(shù)后第3周在手術(shù)對側(cè)RN內(nèi)注射抗IL-6抗體后，大鼠機械性異常性疼痛明顯改善。本研究發(fā)現(xiàn)海馬IL-6水平在SNT術(shù)后第2天開始明顯增高，并且在第7天、11天仍處于較高水平。而應(yīng)用米諾環(huán)素后，在不同時間點IL-6表達均下調(diào)，其中術(shù)后第7天最為顯著。因此，研究推測IL-6可能是海馬參與NP調(diào)控的另一個關(guān)鍵因子，而抑制海馬IL-6的表達是米諾環(huán)素的鎮(zhèn)痛機制之一。但迄今為止，對于IL-6參與NP調(diào)控的具體機制尚不清楚，仍需進一步探索。

綜上所述， SNT可導(dǎo)致大鼠海馬TNF-α、IL-1β、IL-6的水平上調(diào)，而米諾環(huán)素的應(yīng)用能改善SNT大鼠的疼痛行為并抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的表達及釋放，推測海馬參與NP的調(diào)控與海馬內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活及炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放有關(guān)。目前，對于海馬參與NP的研究尚處于初始階段，雖然本研究對于海馬參與NP的調(diào)控進行了初步探討，但對于NP過程中海馬小膠質(zhì)細胞的具體表達變化規(guī)律以及其與海馬神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞之間相關(guān)信號通路和關(guān)鍵信息分子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系尚不清晰，仍有許多細節(jié)及因果關(guān)系有待探究。因此，針對上述疼痛網(wǎng)絡(luò)的探索對于明確海馬參與NP調(diào)控及米諾環(huán)素對NP的臨床治療具有重要意義。